一个未知蛋白的的纯化疑问 - 未名空间MITBBS历史存档

一个未知蛋白的的纯化疑问# Biology - 生物学

t*c2010-12-21 08:12

1 楼

也就是剧本里的痴情男，为了杨雪舞一次又一次不惜生命。
历史上的宇文邕有很多宠妃，生了很多儿子的。
那个贞儿年纪也太小了。宇文邕的哥哥都死了很多年了，女儿怎么会这么小。
现在的电视剧流行皇帝抢女人，而且这些个皇帝（或者王爷）都是非她不娶，
即使认识她之前已经有老婆的，要么休妻，要么搁置，总之是不能不专一。
古代皇帝们要么看了这些剧，肯定笑死编剧的脑残了。当皇帝就是为了得天下
，为了得到美女如云，都这样为了一个女人，既不珍惜江山了，又不要自己性命了，
还不要如云的其他美女了，这皇帝还当个什么劲呢。

m*r2010-12-21 08:12

2 楼

版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
了始终没解决，特上来求救：
是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
不干净。过个Gel filtration 也分不开。
这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。
在黏菌的基因组中，它是跟另一个蛋白在一块的，我可以尝试共表达他们两个，但问题
是，我们的目的是验证这两个蛋白的相互作用，如果这样，我得到了稳定的蛋白
complex，再怎么分开他们呢？
确实很头大，眼看着这个蛋白拿不到，（另一个蛋白早就拿到了，HSQC也有了）想做的
蛋白相互作用没法进行下去，望板上牛人指点迷津。

e*y2010-12-21 08:12

3 楼

按照现实来拍
谁还看电视了？

【在 t*c 的大作中提到】

: 也就是剧本里的痴情男，为了杨雪舞一次又一次不惜生命。
: 历史上的宇文邕有很多宠妃，生了很多儿子的。
: 那个贞儿年纪也太小了。宇文邕的哥哥都死了很多年了，女儿怎么会这么小。
: 现在的电视剧流行皇帝抢女人，而且这些个皇帝（或者王爷）都是非她不娶，
: 即使认识她之前已经有老婆的，要么休妻，要么搁置，总之是不能不专一。
: 古代皇帝们要么看了这些剧，肯定笑死编剧的脑残了。当皇帝就是为了得天下
: ，为了得到美女如云，都这样为了一个女人，既不珍惜江山了，又不要自己性命了，
: 还不要如云的其他美女了，这皇帝还当个什么劲呢。

A*w2010-12-21 08:12

4 楼

跑个胶，拿出杂质蛋白，做个trypsin digested MALDI看看杂质是什么。
50%的soluble是不是分离的蛋白可能是聚集体？试试低温表达。
有loop不稳定结构，加arg+glu到buffer里，是不是可以增加蛋白的溶解特性。
暂时就想到这些。

B*d2010-12-21 08:12

5 楼

历史上宇文邕一共6个后妃，算是少的，为了繁衍子嗣，帝王老婆多是必然的
剧里面也没说宇文邕只有一个皇后
连续剧除了感情部分基本符合史实，很不容易了

【在 t*c 的大作中提到】

: 也就是剧本里的痴情男，为了杨雪舞一次又一次不惜生命。
: 历史上的宇文邕有很多宠妃，生了很多儿子的。
: 那个贞儿年纪也太小了。宇文邕的哥哥都死了很多年了，女儿怎么会这么小。
: 现在的电视剧流行皇帝抢女人，而且这些个皇帝（或者王爷）都是非她不娶，
: 即使认识她之前已经有老婆的，要么休妻，要么搁置，总之是不能不专一。
: 古代皇帝们要么看了这些剧，肯定笑死编剧的脑残了。当皇帝就是为了得天下
: ，为了得到美女如云，都这样为了一个女人，既不珍惜江山了，又不要自己性命了，
: 还不要如云的其他美女了，这皇帝还当个什么劲呢。

m*r2010-12-21 08:12

6 楼

1.老板也说了，但是暗示对现有project意义不大，因为我们就需要的大量的蛋白做个
相互作用的HSQC，所以暂时不主张做
2,我已经18度了，不能再低了吧
3.这个我倒听说过，防止蛋白聚集沉淀吧，可以在Ni柱的buffer里加码？

t*c2010-12-21 08:12

7 楼

宇文邕死的早，真正得势后才三年就死了。要是多活一些年，后妃必然更多。
历史上也就只有杨坚在大老婆活着的时候不敢多宠幸后宫小妾吧，那不是因为爱，
而是因为怕。后来大老婆一死，就开始骄奢淫逸，很快过劳死了。

【在 B********d 的大作中提到】

: 历史上宇文邕一共6个后妃，算是少的，为了繁衍子嗣，帝王老婆多是必然的
: 剧里面也没说宇文邕只有一个皇后
: 连续剧除了感情部分基本符合史实，很不容易了

C*e2010-12-21 08:12

8 楼

你把这个蛋白跟另外一个共表达，一个有tag，一个没有
如果出来complex，（native gel, SEC），不是也是一个他们相互作用的证据么？
另外你his-tag纯化的时候wash buffer里面离子浓度多少？
还有如果实在不行，可以denature条件下纯化这个蛋白
13 kDa这么小，重折叠不是什么大问题
另外既然怀疑这个蛋白二级结构也不多，不如试试你的GST-tag的那个
虽然一开始表达的少
但大不了多摇点菌
GST应该可以帮助稳定这个蛋白
前70aa没有什么可以预测的二级结构的话正好可以在GST-protein里面当linker
纯化好了蛋白再把GST切掉（我假设你的fusion protein是有特异性蛋白水解酶酶切位
点给你切GST的）

p*y2010-12-21 08:12

9 楼

不止杨坚，明朝的明孝宗没有其他妃嫔，只有皇后一人。
还有他们北周继承的那个皇帝，叫元钦的，也只有一个皇后，没有妃子。

m*z2010-12-21 08:12

10 楼

50% 可溶，如果表达良好的话还是可以接受的。
杂蛋白，到底是impurity还是degrading product? gel-filtration分不开，能不能试
试ion exchange column,比如monoQ.用的什么蛋白酶抑制剂？PMSF? 试试看sigma的
inhibitor cocktail?
最后拿到的蛋白纯度大概有多少？如果有80%的话，也许做binding也可以了。mass
spec可以确定那些是不是降解产物。如果是的话，还可以告诉你是在哪里降解的。也许
可以通过mutate那个residue来达到减少降解的目的

【在 m********r 的大作中提到】

: 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
: 了始终没解决，特上来求救：
: 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
: GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
: 在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
: 不干净。过个Gel filtration 也分不开。
: 这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
: 疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
: 面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
: 是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。

r*p2010-12-21 08:12

11 楼

这个贞儿的原型可能是宇文邕姐姐襄阳公主的女儿窦氏,据记载宇文邕很喜欢这个外甥
女,一直养在宫中.
这个窦氏可不是一般人,后来嫁了个老公叫李渊,生了个儿子叫李世民.
"高祖太穆顺圣皇后窦氏，京兆平陵人。父毅，在周为上柱国，尚武帝姊襄阳长公主，
入隋为定州总管、神武公。后生，发垂过颈，三岁与身等。读《女诫》、《列女》等
传，一过辄不忘。武帝爱之，养宫中，异它甥。"

【在 t*c 的大作中提到】

: 也就是剧本里的痴情男，为了杨雪舞一次又一次不惜生命。
: 历史上的宇文邕有很多宠妃，生了很多儿子的。
: 那个贞儿年纪也太小了。宇文邕的哥哥都死了很多年了，女儿怎么会这么小。
: 现在的电视剧流行皇帝抢女人，而且这些个皇帝（或者王爷）都是非她不娶，
: 即使认识她之前已经有老婆的，要么休妻，要么搁置，总之是不能不专一。
: 古代皇帝们要么看了这些剧，肯定笑死编剧的脑残了。当皇帝就是为了得天下
: ，为了得到美女如云，都这样为了一个女人，既不珍惜江山了，又不要自己性命了，
: 还不要如云的其他美女了，这皇帝还当个什么劲呢。

k*u2010-12-21 08:12

12 楼

Reverse phase LC是个好东西。。。
可以RPLC分离的。。。

【在 m********r 的大作中提到】

: 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
: 了始终没解决，特上来求救：
: 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
: GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
: 在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
: 不干净。过个Gel filtration 也分不开。
: 这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
: 疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
: 面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
: 是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。

m*z2010-12-21 08:12

13 楼

这个要denature蛋白的。。。不是万不得已，一般不会去这么干吧

【在 k****u 的大作中提到】

: Reverse phase LC是个好东西。。。
: 可以RPLC分离的。。。

m*r2010-12-21 08:12

14 楼

1.你说的很对，但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计
mutant;
2.buffer里面是250mM,应该不低吧
3.如果本身是个没有高级结构的话，refolding似乎问题也不少吧，怎么知道变回天然
的了？
4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。

【在 C*******e 的大作中提到】

: 你把这个蛋白跟另外一个共表达，一个有tag，一个没有
: 如果出来complex，（native gel, SEC），不是也是一个他们相互作用的证据么？
: 另外你his-tag纯化的时候wash buffer里面离子浓度多少？
: 还有如果实在不行，可以denature条件下纯化这个蛋白
: 13 kDa这么小，重折叠不是什么大问题
: 另外既然怀疑这个蛋白二级结构也不多，不如试试你的GST-tag的那个
: 虽然一开始表达的少
: 但大不了多摇点菌
: GST应该可以帮助稳定这个蛋白
: 前70aa没有什么可以预测的二级结构的话正好可以在GST-protein里面当linker

s*e2010-12-21 08:12

15 楼

try on-gel cleavage instead of eluting with imidazole

m*z2010-12-21 08:12

16 楼

1. 如果另一个蛋白你有很多的话，不妨先用现有的不是很纯的蛋白试试看HSQC.如果那
些是杂蛋白，不应该影响你的HSQC吧？（assuming the other protein is N15-
labeled)

【在 m********r 的大作中提到】

: 1.你说的很对，但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计
: mutant;
: 2.buffer里面是250mM,应该不低吧
: 3.如果本身是个没有高级结构的话，refolding似乎问题也不少吧，怎么知道变回天然
: 的了？
: 4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。

k*u2010-12-21 08:12

17 楼

用salt和water，不要用organic solvent，可以minimize denaturation
当然，我没干过，只是纸上谈兵-_-

【在 m**z 的大作中提到】

: 这个要denature蛋白的。。。不是万不得已，一般不会去这么干吧

C*e2010-12-21 08:12

18 楼

"2.buffer里面是250mM,应该不低吧"
——250 mM还好啦
试试看500 mM
给你看个我的某个his蛋白纯化的比较
另外我说GST tag帮助你这个没什么二级结构的蛋白折叠不是说GST tag小
我反而觉得大一点的tag可能更有帮助
refold能不能回到native？这个问题不好回答。所以一般而言denature条件纯化是最后
一个选择

【在 m********r 的大作中提到】

: 1.你说的很对，但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计
: mutant;
: 2.buffer里面是250mM,应该不低吧
: 3.如果本身是个没有高级结构的话，refolding似乎问题也不少吧，怎么知道变回天然
: 的了？
: 4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。

s*n2010-12-21 08:12

19 楼

建议试试用Cobalt的柱子代替Ni的柱子，我的蛋白用Cobalt的柱子一步就>90%，很顺利
做出结晶。

e*s2010-12-21 08:12

20 楼

为什么不在Nickle以后试一下离子交换柱子或者疏水柱子？

【在 m********r 的大作中提到】

: 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
: 了始终没解决，特上来求救：
: 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
: GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
: 在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
: 不干净。过个Gel filtration 也分不开。
: 这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
: 疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
: 面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
: 是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。

m*r2010-12-21 08:12

21 楼

Btw,你的蛋白在我眼里已经很纯了，250或者 500的盐都是，我都不好意思上我的胶图
了，我的融合蛋白量（25KD）在全菌裂解里也有70%以上是目标蛋白，但是到了咪唑洗
脱就成了40%的样子，主要就是在10-15KD有两个很大量的杂蛋白。这个让我感觉是降解
的；
GST 我有另一个麻烦，就是free GST很多，摇再多的菌，也有一半以上的GST 结合到
beads上，fusion protein相对结合的少啊，这也是我GST表达一直没解决的问题。
至于说离子交换，我还没试。但我想尝试上来就用它，而不是Ni之后。我们没有mono的
，都是大体积的。不知道有什么要注意的
还有就是大家有没有用那个pET-DUET载体成功表达稳定蛋白的例子啊，我在国内的时候
试过，不是很好用。

【在 C*******e 的大作中提到】

: "2.buffer里面是250mM,应该不低吧"
: ——250 mM还好啦
: 试试看500 mM
: 给你看个我的某个his蛋白纯化的比较
: 另外我说GST tag帮助你这个没什么二级结构的蛋白折叠不是说GST tag小
: 我反而觉得大一点的tag可能更有帮助
: refold能不能回到native？这个问题不好回答。所以一般而言denature条件纯化是最后
: 一个选择

m*r2010-12-21 08:12

22 楼

你指的是我label另一个蛋白，用这个不纯的蛋白做titration吧，还是反过来label？
我前者已经做了，但是要想完成titration，需要量很大啊（10：1 molar equivalent
）差不多就是2mM了。我用GSTtag纯化的时候就卡在这一步了。现在换了Ni柱，又得不
到纯蛋白了

【在 m**z 的大作中提到】

: 1. 如果另一个蛋白你有很多的话，不妨先用现有的不是很纯的蛋白试试看HSQC.如果那
: 些是杂蛋白，不应该影响你的HSQC吧？（assuming the other protein is N15-
: labeled)

m*z2010-12-21 08:12

23 楼

我知道NMR titration需要很高浓度。。。如果有cryo probe的话，HSQC 100uM 甚至更
低些应该也能work。你没完成的titration能不能给你些关于binding site的idea呢？
GSTtag如果work的话，多纯化几批能不能work呢？
前面你提到10-15kDa有两个杂蛋白，你的蛋白多大呀？这两个蛋白的分子量加起来和你
的蛋白比怎么样？

equivalent

【在 m********r 的大作中提到】

: 你指的是我label另一个蛋白，用这个不纯的蛋白做titration吧，还是反过来label？
: 我前者已经做了，但是要想完成titration，需要量很大啊（10：1 molar equivalent
: ）差不多就是2mM了。我用GSTtag纯化的时候就卡在这一步了。现在换了Ni柱，又得不
: 到纯蛋白了

m*r2010-12-21 08:12

24 楼

如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
不知道谁的对；
我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
蛋白的N端，有可能吗？

【在 m**z 的大作中提到】

: 我知道NMR titration需要很高浓度。。。如果有cryo probe的话，HSQC 100uM 甚至更
: 低些应该也能work。你没完成的titration能不能给你些关于binding site的idea呢？
: GSTtag如果work的话，多纯化几批能不能work呢？
: 前面你提到10-15kDa有两个杂蛋白，你的蛋白多大呀？这两个蛋白的分子量加起来和你
: 的蛋白比怎么样？
:
: equivalent

C*e2010-12-21 08:12

25 楼

如果你担心fusion protein从中间断了，elution里才会有两条蛋白带
那就做个his-tag的WB好了
两个都有his-tag就证明你的担心是对的

【在 m********r 的大作中提到】

: 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
: 上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
: loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
: 不知道谁的对；
: 我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
: 是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
: 蛋白的N端，有可能吗？

m*z2010-12-21 08:12

26 楼

要做assignment就没折了。。。
挺有可能从中间断了。。。in-gel tryptic digestion followed by MS-MS 可以确定
的告诉你，不过我也不知道这个信息对你有多大用处。。。我之前说聊唯一好处是你可
以make mutation,把那个residue换掉。反正挺折腾得。。。

【在 m********r 的大作中提到】

: 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
: 上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
: loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
: 不知道谁的对；
: 我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
: 是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
: 蛋白的N端，有可能吗？

s*s2010-12-21 08:12

27 楼

13KD的蛋白加上这么大的一个tag可能会影响相互作用。

【在 m********r 的大作中提到】

: 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
: 上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
: loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
: 不知道谁的对；
: 我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
: 是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
: 蛋白的N端，有可能吗？

i*g2010-12-21 08:12

28 楼

唉，年纪大了。没有耐心了，要是几年前，还有兴致码字回答

C*e2010-12-21 08:12

29 楼

您这不是码了字了么～～
年纪大了，经验多了，更要提携新人啊～

【在 i*****g 的大作中提到】

: 唉，年纪大了。没有耐心了，要是几年前，还有兴致码字回答

m*r2010-12-21 08:12

30 楼

对啊，希望您不吝指教啊

【在 i*****g 的大作中提到】

: 唉，年纪大了。没有耐心了，要是几年前，还有兴致码字回答

z*g2010-12-21 08:12

31 楼

1.不知道你是不是纯化做的不多还是太矫情，从你的电泳图来看，那已经很纯了。下次
优化一下
ni column的过程，再过个Q、S，gel filtration之类的，那点杂带早就不见了。而且
你做NMR，
又不用结晶，也用不着那么纯。
2.做complex的都愁着蛋白不结合，没有人愁着结合的分不开。想分开办法多着呢，提
高NaCl浓
度，离子交换什么的都可以试试

【在 m********r 的大作中提到】

: 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
: 了始终没解决，特上来求救：
: 是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
: GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
: 在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
: 不干净。过个Gel filtration 也分不开。
: 这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
: 疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
: 面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
: 是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。

m*r2010-12-21 08:12

32 楼

第二点我老板倒也说过，提高盐浓度；
第一点你说的基本也对，不过，那不是我的胶图啊，我要是那纯化效果，就不来费这个
事儿了，

【在 z******g 的大作中提到】

:
: 1.不知道你是不是纯化做的不多还是太矫情，从你的电泳图来看，那已经很纯了。下次
: 优化一下
: ni column的过程，再过个Q、S，gel filtration之类的，那点杂带早就不见了。而且
: 你做NMR，
: 又不用结晶，也用不着那么纯。
: 2.做complex的都愁着蛋白不结合，没有人愁着结合的分不开。想分开办法多着呢，提
: 高NaCl浓
: 度，离子交换什么的都可以试试