n*j
2 楼
狗的爸今天问了一堆业余问题，什么通知没收到怎么办，真服了 。。。
S*e
3 楼
我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
？大家怎么解决这个问题的。
Happy Holiday!
备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
？大家怎么解决这个问题的。
Happy Holiday!
c*d
4 楼
祝水过
b*g
5 楼
想通知数据库生成订单再返回，还想要每秒百万次？还单线程。真他妈傻逼。我要是狗
的爸，你就是狗。
【在 n****j 的大作中提到】
: 狗的爸今天问了一堆业余问题，什么通知没收到怎么办，真服了 。。。
的爸，你就是狗。
【在 n****j 的大作中提到】
: 狗的爸今天问了一堆业余问题，什么通知没收到怎么办，真服了 。。。
n*k
6 楼
either too confluent, or you didn't handle with care...or your cells have
been too old etc...Make sure you cells
are fine and then handle with care, never overgrow them...Alternative, coat
plates with poly-Lysine, still never
overgrow the cells...
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
been too old etc...Make sure you cells
are fine and then handle with care, never overgrow them...Alternative, coat
plates with poly-Lysine, still never
overgrow the cells...
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
b*e
7 楼
bless
n*j
8 楼
12306 需要每秒百万次吗？别的不说，你丫问的问题业余不业余，别打滚，自己掌嘴
【在 b*******g 的大作中提到】
: 想通知数据库生成订单再返回，还想要每秒百万次？还单线程。真他妈傻逼。我要是狗
: 的爸，你就是狗。
【在 b*******g 的大作中提到】
: 想通知数据库生成订单再返回，还想要每秒百万次？还单线程。真他妈傻逼。我要是狗
: 的爸，你就是狗。
l*e
9 楼
应该你操作不小心，细胞可能状态不好， 不过 和上面说的想反， 如果你细胞过少的
话， 也容易脱。
话， 也容易脱。
R*0
10 楼
祝顺利通过！
b*g
11 楼
傻逼你丫这是认怂了？太监要做百万次，你丫可是拍脑袋没问题。
【在 n****j 的大作中提到】
: 12306 需要每秒百万次吗？别的不说，你丫问的问题业余不业余，别打滚，自己掌嘴
【在 n****j 的大作中提到】
: 12306 需要每秒百万次吗？别的不说，你丫问的问题业余不业余，别打滚，自己掌嘴
r*e
12 楼
coating很管用，你用什么方法转啊？
转之前不换液就不会掉了。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
转之前不换液就不会掉了。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
R*0
13 楼
过了吗？求签经
n*j
14 楼
我不知道百万次行不行，理论上也不是不可能。你丫今天问了几个傻逼问题啊？
【在 b*******g 的大作中提到】
: 傻逼你丫这是认怂了？太监要做百万次，你丫可是拍脑袋没问题。
【在 b*******g 的大作中提到】
: 傻逼你丫这是认怂了？太监要做百万次，你丫可是拍脑袋没问题。
n*k
15 楼
with non-coated plates, unless very experienced and careful, never change
medium right before the
transfection, the cells will cluster and decrease efficiency...could change
the medium 6-12 hrs before hand...
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
medium right before the
transfection, the cells will cluster and decrease efficiency...could change
the medium 6-12 hrs before hand...
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
Z*i
16 楼
bless!
【在 h*******r 的大作中提到】
: 爸妈10下午在北京签证，求大家的祝福。等签过了，一定上来更新签证经验。
: 多谢多谢！
【在 h*******r 的大作中提到】
: 爸妈10下午在北京签证，求大家的祝福。等签过了，一定上来更新签证经验。
: 多谢多谢！
b*g
17 楼
你丫不知道行不行，你丫就出来把鸡吧卖了。我老早跟你说了机器好点，1万不难，你
俩傻逼非要撑100万你怪谁。
【在 n****j 的大作中提到】
: 我不知道百万次行不行，理论上也不是不可能。你丫今天问了几个傻逼问题啊？
俩傻逼非要撑100万你怪谁。
【在 n****j 的大作中提到】
: 我不知道百万次行不行，理论上也不是不可能。你丫今天问了几个傻逼问题啊？
S*e
18 楼
我用Roche 的 FuGENE6 转。我在转之前的确换液了，要除掉抗生素，但操作很小心，
还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
吗？
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
吗？
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
n*j
19 楼
老魏测试过说行，我没测试过只有大概估算可以，所以我不确认行不行。爷跟你不一样
啊，不确定就是不确定。但不会问傻逼问题，比如通知没收到怎么办 LOL。
另外，你啥时候看见我卖你鸡巴了？
【在 b*******g 的大作中提到】
: 你丫不知道行不行，你丫就出来把鸡吧卖了。我老早跟你说了机器好点，1万不难，你
: 俩傻逼非要撑100万你怪谁。
啊，不确定就是不确定。但不会问傻逼问题，比如通知没收到怎么办 LOL。
另外，你啥时候看见我卖你鸡巴了？
【在 b*******g 的大作中提到】
: 你丫不知道行不行，你丫就出来把鸡吧卖了。我老早跟你说了机器好点，1万不难，你
: 俩傻逼非要撑100万你怪谁。
S*e
20 楼
请问怎么coating, 我没做过。请指教。
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
【在 r***e 的大作中提到】
: coating很管用，你用什么方法转啊？
: 转之前不换液就不会掉了。
b*g
21 楼
太监说100万能行，你摇旗呐喊就是行就是行，你丫就跟他一起做太监吧。不确认你就
拿出鸡巴来叫嚣你丫是不是傻逼呀。
【在 n****j 的大作中提到】
: 老魏测试过说行，我没测试过只有大概估算可以，所以我不确认行不行。爷跟你不一样
: 啊，不确定就是不确定。但不会问傻逼问题，比如通知没收到怎么办 LOL。
: 另外，你啥时候看见我卖你鸡巴了？
拿出鸡巴来叫嚣你丫是不是傻逼呀。
【在 n****j 的大作中提到】
: 老魏测试过说行，我没测试过只有大概估算可以，所以我不确认行不行。爷跟你不一样
: 啊，不确定就是不确定。但不会问傻逼问题，比如通知没收到怎么办 LOL。
: 另外，你啥时候看见我卖你鸡巴了？
n*k
22 楼
Antibotics is not really a big concern...
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我用Roche 的 FuGENE6 转。我在转之前的确换液了，要除掉抗生素，但操作很小心，
: 还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
: 吗？
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我用Roche 的 FuGENE6 转。我在转之前的确换液了，要除掉抗生素，但操作很小心，
: 还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
: 吗？
n*j
23 楼
傻逼又造谣了，我哪个帖子说 100 万可以的，你拿出来看看
【在 b*******g 的大作中提到】
: 太监说100万能行，你摇旗呐喊就是行就是行，你丫就跟他一起做太监吧。不确认你就
: 拿出鸡巴来叫嚣你丫是不是傻逼呀。
【在 b*******g 的大作中提到】
: 太监说100万能行，你摇旗呐喊就是行就是行，你丫就跟他一起做太监吧。不确认你就
: 拿出鸡巴来叫嚣你丫是不是傻逼呀。
r*e
24 楼
你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
加培养液和细胞。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我用Roche 的 FuGENE6 转。我在转之前的确换液了，要除掉抗生素，但操作很小心，
: 还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
: 吗？
买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
加培养液和细胞。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我用Roche 的 FuGENE6 转。我在转之前的确换液了，要除掉抗生素，但操作很小心，
: 还是掉。大家说得对，干脆种的时候就不加抗生素了，这样就不用换液了。大家觉得行
: 吗？
b*g
25 楼
太监说能100万，你丫跳出来支持他，这是没了鸡吧要装回去的节奏？
【在 n****j 的大作中提到】
: 傻逼又造谣了，我哪个帖子说 100 万可以的，你拿出来看看
【在 n****j 的大作中提到】
: 傻逼又造谣了，我哪个帖子说 100 万可以的，你拿出来看看
S*e
26 楼
谢谢。去core lab看看有没有poly-Lysine, 买一瓶。用无菌水稀释吗？
【在 r***e 的大作中提到】
: 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
: 买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
: 加培养液和细胞。
【在 r***e 的大作中提到】
: 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
: 买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
: 加培养液和细胞。
n*j
27 楼
我同意老魏的架构，有没有 100 万我不知道，傻逼你一天不造谣会死啊？
【在 b*******g 的大作中提到】
: 太监说能100万，你丫跳出来支持他，这是没了鸡吧要装回去的节奏？
【在 b*******g 的大作中提到】
: 太监说能100万，你丫跳出来支持他，这是没了鸡吧要装回去的节奏？
r*e
28 楼
一般都是PBS吧。
其实病毒生成以后，细胞也容易漂，所以coating以后是一举两得。你做过就知道了。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 谢谢。去core lab看看有没有poly-Lysine, 买一瓶。用无菌水稀释吗？
其实病毒生成以后，细胞也容易漂，所以coating以后是一举两得。你做过就知道了。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 谢谢。去core lab看看有没有poly-Lysine, 买一瓶。用无菌水稀释吗？
b*g
29 楼
那就好，太监拿了个太监计数器出来，你跟他一起打脸。后来知道不行要单线程，尿遁
，继续打脸。
你俩难兄难弟，一起做太监。
【在 n****j 的大作中提到】
: 我同意老魏的架构，有没有 100 万我不知道，傻逼你一天不造谣会死啊？
，继续打脸。
你俩难兄难弟，一起做太监。
【在 n****j 的大作中提到】
: 我同意老魏的架构，有没有 100 万我不知道，傻逼你一天不造谣会死啊？
S*e
30 楼
再请教一下，是poly-D-Lysine 还是poly-L-Lysine?
【在 r***e 的大作中提到】
: 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
: 买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
: 加培养液和细胞。
【在 r***e 的大作中提到】
: 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
: 买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
: 加培养液和细胞。
t*1
31 楼
这两天大家都看出你啥德性了。
明天去NFLX搞你估计基本没人会有意见了。
【在 b*******g 的大作中提到】
: 那就好，太监拿了个太监计数器出来，你跟他一起打脸。后来知道不行要单线程，尿遁
: ，继续打脸。
: 你俩难兄难弟，一起做太监。
明天去NFLX搞你估计基本没人会有意见了。
【在 b*******g 的大作中提到】
: 那就好，太监拿了个太监计数器出来，你跟他一起打脸。后来知道不行要单线程，尿遁
: ，继续打脸。
: 你俩难兄难弟，一起做太监。
a*d
32 楼
I coated the plates with gelatin/PBS to prevent cells detaching. If you
handle the cells carefully enough, you don't really have to coat the plates.
When you changing medium, do one plate per time, and don't try to change
medium for more than 3 plates in one shot. Cells don't like being exposed to
air for too long. Another thing is to, add medium or PBS to the wall but
not directly to the cells.
handle the cells carefully enough, you don't really have to coat the plates.
When you changing medium, do one plate per time, and don't try to change
medium for more than 3 plates in one shot. Cells don't like being exposed to
air for too long. Another thing is to, add medium or PBS to the wall but
not directly to the cells.
b*g
33 楼
太监，你丫都说了两周了，尼玛有完没完。
【在 t**********1 的大作中提到】
: 这两天大家都看出你啥德性了。
: 明天去NFLX搞你估计基本没人会有意见了。
【在 t**********1 的大作中提到】
: 这两天大家都看出你啥德性了。
: 明天去NFLX搞你估计基本没人会有意见了。
G*e
34 楼
我用过trypsin处理后的细胞悬液直接加LF的转染mix
没什么问题
我也用过带抗生素的media
也能有virus
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
没什么问题
我也用过带抗生素的media
也能有virus
【在 S**********e 的大作中提到】
: 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
: 备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
: ？大家怎么解决这个问题的。
: Happy Holiday!
l*e
35 楼
antibiotics does not matter if you use fugene6. I remember the company state
it in the protocol.
it in the protocol.
S*e
36 楼
看样子出病毒不太困难，说不定我的上清里也有病毒了。
Thanks all who replied and happy holiday!
【在 G********e 的大作中提到】
: 我用过trypsin处理后的细胞悬液直接加LF的转染mix
: 没什么问题
: 我也用过带抗生素的media
: 也能有virus
Thanks all who replied and happy holiday!
【在 G********e 的大作中提到】
: 我用过trypsin处理后的细胞悬液直接加LF的转染mix
: 没什么问题
: 我也用过带抗生素的media
: 也能有virus
Z*5
37 楼
养了一年半细胞了，从来没有用过抗生素，也没有污染过。
另外我转染都用罗氏的FuGene HD，不用换液，操作简单。 我们实验室转293T的都用这
个。
另外我转染都用罗氏的FuGene HD，不用换液，操作简单。 我们实验室转293T的都用这
个。
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