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诡异的qPCR，请高手指点

诡异的qPCR，请高手指点# Biology - 生物学

j*a2011-01-07 08:01

1 楼

我做的蛋糕一直挺好吃，但爬墙能力不够，总是让我心存遗憾。昨天又试了一次，正好
买到了一盒巨大无比的鸡蛋（我们一直买的是 Eggland's Best Organic，但从来没那
么大的）。我正在考虑如何调整菜谱，又打到了一个双黄蛋，一下子我的脑子里一团浆
糊，只能留出一个蛋黄，减少一个全蛋。
首先调出来的蛋黄糊非常稠，我又急忙加了点蜂蜜，倒了点冷牛奶进去（想象我的手忙
脚乱吧），使劲搅拌才拌匀了。
其次蛋白打发异常顺利，才三分钟就硬性发泡了，而且蛋白糊膨胀的程度比平时多好
多。
最后，哈哈，就在我认定这次蛋糕肯定失败了的时候，漂亮的蛋糕出炉啦！我的面粉搅
拌还是有问题，即使把油加热了，把面粉都筛过了，两者混在一起的时候还是容易形成
小面粒，不过不求完美的我还是很满意了。
BTW，这是9寸的圆盘。

H*a2011-01-07 08:01

2 楼

【以下文字转载自 Visa 讨论区】
发信人: Hyena (阿盆), 信区: Visa
标题: 请教OPT申请的问题
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 13 01:40:42 2009, 美东)
我的情况：
F-1学生身份，打算开始申请OPT；
12月中旬答辩，3月1日开始上班，中间希望能回国一趟。
答辩前回国是最保险，但这个可能性很小，老板很难同意；推迟答辩也不可能，我老板
不愿意多付我下个学期的注册费用。
如果答辩后回国，现在向学校OISS申请OPT时对方要求我提供的时间（这个就是
supposedly我OPT开始的时间吧）应该怎么填好？OISS要求是我答辩当天的时间，还要
有我老板的签字。但我听说如果万一实际答辩时间晚于这个时间手续会变得很麻烦，可
能还需要重新申请OPT。所以上报的时间应该尽可能晚于预定的答辩时间。
那么如果我在答辩过后到这个上报的时间之间回国，返签的时候算不算OPT pending?如
果这样不保险，我是不是等拿到EAD卡再回国比较稳妥？拿到EAD卡的时间一般跟我之前
上报OISS的时间会间隔多久？
请大家给点一建议。非常感谢！！

m*d2011-01-07 08:01

3 楼

新设计了primer，扩增genomic DNA的某片段，170bp左右，用qPCR来定量，primer退火
温度已测好，57°C
用SYBR green做qPCR，SYBR新从BioRad订的
25μl total volume
12.5μl SYBR green master mix + 0.1μl primerF (0.1μM in the fianl
concentration)+ 0.1μl primerR + 50ng genomic DNA + H2O fill up to 25μl
用的PCR program如下：
95°C 10min + (95°C 30sec, 57°C 30sec, 72°C 30sec) 40cycle + dissociation
curve
72°C elongation step读数
结果没有任何信号，dissociation curve当然也没信号或者有一些非常弱且杂乱的信号
我把sample拿出来，跑了个2%agar gel，结果非常清晰干净的一条带，size完全正确，
看不到primer dimer或者其他non-specific band
qPCR怎么回事呢，我是新手，没啥经验，请高手们指点指点，多谢

F*t2011-01-07 08:01

4 楼

哈哈,阴差阳错哈.
不过蛋糕发的还真不错

c*r2011-01-07 08:01

5 楼

opt 开始时间就是你新i20上program截止的时间。理论上你可以设定这学期末，如果要
想定在下学期某天，下学期就要注册学分。
现在从申请到拿到卡大概一个月左右。（我用了一个月另一周，NSC）。
即使你拿到卡，回去也比较麻烦，毕竟i20过期失效了。总之，opt期间，我们学校的
isss都不建议回国。。当然也有很多人回去了，说没啥事。。。

【在 H***a 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 Visa 讨论区】
: 发信人: Hyena (阿盆), 信区: Visa
: 标题: 请教OPT申请的问题
: 发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 13 01:40:42 2009, 美东)
: 我的情况：
: F-1学生身份，打算开始申请OPT；
: 12月中旬答辩，3月1日开始上班，中间希望能回国一趟。
: 答辩前回国是最保险，但这个可能性很小，老板很难同意；推迟答辩也不可能，我老板
: 不愿意多付我下个学期的注册费用。
: 如果答辩后回国，现在向学校OISS申请OPT时对方要求我提供的时间（这个就是

X*n2011-01-07 08:01

6 楼

Are you sure you used SYBR as probe? Have you set ROX as reference?

c*u2011-01-07 08:01

7 楼

呵呵，不错不凑，找着感觉了哈。

【在 j*******a 的大作中提到】

: 我做的蛋糕一直挺好吃，但爬墙能力不够，总是让我心存遗憾。昨天又试了一次，正好
: 买到了一盒巨大无比的鸡蛋（我们一直买的是 Eggland's Best Organic，但从来没那
: 么大的）。我正在考虑如何调整菜谱，又打到了一个双黄蛋，一下子我的脑子里一团浆
: 糊，只能留出一个蛋黄，减少一个全蛋。
: 首先调出来的蛋黄糊非常稠，我又急忙加了点蜂蜜，倒了点冷牛奶进去（想象我的手忙
: 脚乱吧），使劲搅拌才拌匀了。
: 其次蛋白打发异常顺利，才三分钟就硬性发泡了，而且蛋白糊膨胀的程度比平时多好
: 多。
: 最后，哈哈，就在我认定这次蛋糕肯定失败了的时候，漂亮的蛋糕出炉啦！我的面粉搅
: 拌还是有问题，即使把油加热了，把面粉都筛过了，两者混在一起的时候还是容易形成

H*a2011-01-07 08:01

8 楼

非常感谢你的回复！现在从申请到拿到卡速度比想象的快啊。
嗯,我opt开始的时间肯定是要早于我I20的截止时间。我想现在最可行的是利用答辩的
时间到上报OISS的那个时间中间的空当回国。我的问题是：因为我打算这两天开始申请
OPT，那个空当回国算不算opt pending以至于不容易返签？
谢谢！

【在 c*******r 的大作中提到】

: opt 开始时间就是你新i20上program截止的时间。理论上你可以设定这学期末，如果要
: 想定在下学期某天，下学期就要注册学分。
: 现在从申请到拿到卡大概一个月左右。（我用了一个月另一周，NSC）。
: 即使你拿到卡，回去也比较麻烦，毕竟i20过期失效了。总之，opt期间，我们学校的
: isss都不建议回国。。当然也有很多人回去了，说没啥事。。。

c*r2011-01-07 08:01

9 楼

问一句，你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
sybr mix是多少乘的？
另外你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？

d*e2011-01-07 08:01

10 楼

###此帖已应当事人要求删除###

c*r2011-01-07 08:01

11 楼

你申请opt，你学校iss就会给你一个新的i20，short你的program时间到你opt开始的前
一天。这个不是你能选择的。
如果你还不明白，去iss仔细咨询吧。

【在 H***a 的大作中提到】

: 非常感谢你的回复！现在从申请到拿到卡速度比想象的快啊。
: 嗯,我opt开始的时间肯定是要早于我I20的截止时间。我想现在最可行的是利用答辩的
: 时间到上报OISS的那个时间中间的空当回国。我的问题是：因为我打算这两天开始申请
: OPT，那个空当回国算不算opt pending以至于不容易返签？
: 谢谢！

f*r2011-01-07 08:01

12 楼

我替楼主回答这些问题:
你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
答：是EB
sybr mix是多少乘的？
答：2x
你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？
答：55-95度。每个梯度0.5度，共80个梯度。

【在 c******r 的大作中提到】

: 问一句，你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
: sybr mix是多少乘的？
: 另外你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？

l*s2011-01-07 08:01

13 楼

真好
最想做的蛋糕，不过没有搅拌器，做过2次不理想

H*a2011-01-07 08:01

14 楼

谢谢你的回复

【在 c*******r 的大作中提到】

: 你申请opt，你学校iss就会给你一个新的i20，short你的program时间到你opt开始的前
: 一天。这个不是你能选择的。
: 如果你还不明白，去iss仔细咨询吧。

c*r2011-01-07 08:01

15 楼

哦，那跑完SYBR PCR能不能直接跑胶，不要用EB？
一般UV应该可以看到条带的。如果直接看SYBR看不到，再用EB染一下，如果能看到，说
明SYBR有问题。

【在 f*********r 的大作中提到】

: 我替楼主回答这些问题:
: 你跑胶是直接看的sybr还是EB staining?
: 答：是EB
: sybr mix是多少乘的？
: 答：2x
: 你的dissociation curve从多少度到多少度的范围啊？
: 答：55-95度。每个梯度0.5度，共80个梯度。

l*22011-01-07 08:01

16 楼

做的真好，我每次都发的不好

n*r2011-01-07 08:01

17 楼

你回国需要申请签证吗
如果不需要，带着written job offer，不管是opt还是opt pending入关都没有问题
如果opt期间没有wirtten job offer离境，opt失效
如果你已经开始opt申请，I20过期，但是在I20背面会注明opt pending这个时候可以入
关，回来继续找工作
以上是我问我们学校ISO的官方说法，对方当场给我看了入关网页的FAQ
另外还有一个保险点的方法是，你答辩过后拖着论文不要交，下学期注册non-resident
parttime student，学费我们学校是$150,可以你自己出不要你老板出，等你回来再把
论文交流，这样你回国期间I20不会过期，还是学生身份。另外这个不影响你的opt申请
，opt可以在完成除了thesis以外全部学位要求以后申请，所以你还是可以申请opt2月
底开始

【在 H***a 的大作中提到】

c*y2011-01-07 08:01

18 楼

一个最愚蠢的出错可能，也是一个我好几个学生都出过错的情况：
PCR tube的位置和激光采样的位置不一样。
所以，PCR反应很好，激光采样啥也没有。

E*A2011-01-07 08:01

19 楼

很发

H*a2011-01-07 08:01

20 楼

抱歉现在才回复。非常感谢你的详细解答！！
我回国需要申请签证(还是F-1签证对吧),同时我手边有written job offer.
根据你的说法,最保险的是先按着论文不交保证F-1身份去签visa对么？但我们学校ISO
的说法是I-20会short到我论文答辩当天，不管我是不是交论文，都算OPT pending，这
样回国前的时候身份就很尴尬。
我现在就必须开始申请OPT了，这个job offer对我回国签证有帮助么？谢谢，同时请接
收包子！

m*d2011-01-07 08:01

21 楼

double check了，位置没load错
实验室的qPCR仪一直用来做taqman，很多年没人用过SYBR green了，我觉得可能是
detector坏掉了
还有别的啥可能么

【在 c*********y 的大作中提到】

: 一个最愚蠢的出错可能，也是一个我好几个学生都出过错的情况：
: PCR tube的位置和激光采样的位置不一样。
: 所以，PCR反应很好，激光采样啥也没有。

s*m2011-01-07 08:01

22 楼

看着就想吃！

c*y2011-01-07 08:01

23 楼

filter选错的可能性应该很小。

【在 m**********d 的大作中提到】

: double check了，位置没load错
: 实验室的qPCR仪一直用来做taqman，很多年没人用过SYBR green了，我觉得可能是
: detector坏掉了
: 还有别的啥可能么

j*a2011-01-07 08:01

24 楼

上次发帖时有个 hyesun 朋友给我个建议：“batter放进去后，倾斜一下烤盘转几圈，
让batter沾到比较高的位置，有利于真正烤得时候蛋糕往上爬。”真的挺有用的。

【在 l*******2 的大作中提到】

: 做的真好，我每次都发的不好

m*d2011-01-07 08:01

25 楼

问了一圈人，可能是pPCR machine跟reagent不compatible
实验室的qPCR仪是ABI 7300，订的是bio-rad的SYBR,据说要想用这个机器需要另加ROX
，或者换到ABI7900机器，或者从ABI订SYBR green(has ROX in it)

dissociation

【在 m**********d 的大作中提到】

: 新设计了primer，扩增genomic DNA的某片段，170bp左右，用qPCR来定量，primer退火
: 温度已测好，57°C
: 用SYBR green做qPCR，SYBR新从BioRad订的
: 25μl total volume
: 12.5μl SYBR green master mix + 0.1μl primerF (0.1μM in the fianl
: concentration)+ 0.1μl primerR + 50ng genomic DNA + H2O fill up to 25μl
: 用的PCR program如下：
: 95°C 10min + (95°C 30sec, 57°C 30sec, 72°C 30sec) 40cycle + dissociation
: curve
: 72°C elongation step读数

l*t2011-01-07 08:01

26 楼

漂亮

c*r2011-01-07 08:01

27 楼

嗨，如果这个问题好解决。
7300用ROX做internal reference。bio-rad没有ROX。不过没关系，7300可以调设置，
直接把ROX的reading去掉就可以了。你看看manual，自己设个新的program，不用ROX就
可以了，不用换reagent。

ROX

【在 m**********d 的大作中提到】

: 问了一圈人，可能是pPCR machine跟reagent不compatible
: 实验室的qPCR仪是ABI 7300，订的是bio-rad的SYBR,据说要想用这个机器需要另加ROX
: ，或者换到ABI7900机器，或者从ABI订SYBR green(has ROX in it)
:
: dissociation

s*i2011-01-07 08:01

28 楼

做得很好