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大家有没有经历过这种情况？

大家有没有经历过这种情况？# Biology - 生物学

z*i2011-03-04 08:03

1 楼

是个teaching school。。。第一学期下来觉得压力一般，学生review都不错，就惦记
着生娃了（30了啊！），但和ld异地，东西海岸。。。每个月能见上10天吧（他公司让他
work from home）。。。能生吗？过来人说说。。。。冷水热水都泼点吧。。。。。

A*t2011-03-04 08:03

2 楼

请指点.谢谢.

p*a2011-03-04 08:03

3 楼

虽然作者行文节奏总是有种仓促感
但这属于现实主义意淫小说，贴近生活，紧跟时事
看来最近更新不力，作者也在观望，你妹的.......
摘段搞笑
"电视里放着新闻，又一名正部级领导被中纪委调查，刘汉东心中一亮，刘飞不过是副
省级市长，有个省委书记的岳父而已，他在近江乃至江东可以只手遮天，但他的手遮不
住中国，遮不住世界，康师傅这种级别的大佬都能拉下马，何况一个小小的省会市长，
对，就按照中央打老虎的经验，先把他的外围一个个的清理掉，相当于把老虎的爪子剁
掉，牙齿掰掉，最后把这只老虎打死"

w*y2011-03-04 08:03

4 楼

因为平时大部分时候都有wifi用，好几天都可以用不到3G的数据。
这样一来，要用3G的时候就连不上，只能关机重启。
试过打开airplane mode再关上，不管用:(
是我手机的问题还是att的问题呢？

b*82011-03-04 08:03

5 楼

小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来
实在没办法，把以前shRNA的序列发给Dharmacon公司，让他们合成siRNA,然后又能重复
到以前的现象。
我现在怀疑前面的A调节B的发现很可能是shRNA的脱靶效应。因为我用新的siRNA（就是
和shRNA序列一样的那个）做了很多机制方面的研究，包括B基因启动子的报告基因实验
，组蛋白乙酰化和甲基化修饰，DNA甲基化等都是阴性。老板是AP，压力大，老嫌我进
度慢，由于长期对我的结果不满意，现在都不怎么礼拜我，严重缺少交流。
已经快崩溃了，请版里的大侠支招啊，谈谈这个课题还能怎么做下去，谢谢了

y*r2011-03-04 08:03

6 楼

一个人怀孕会很辛苦。尤其到后面的时候。
如果实在想现在要，邀请父母过来吧。照顾照顾。孕吐的时候，行动不方便的时候，或
者坐月子，帮忙做做饭也是好的。

g*u2011-03-04 08:03

7 楼

哪个和你在一个气场选哪个

X*r2011-03-04 08:03

8 楼

我觉得节奏蛮好。
这本书就好在专心讲故事，主角既没怎么升级也没怎么泡妞，有打脸但也偶尔被打脸。
就好比打游戏最后一滴血干掉老怪（或者差点没被老怪干掉但是成功逃脱没死），比开
了无敌光环轻松捏死老怪那可是爽多了。

【在 p********a 的大作中提到】

: 虽然作者行文节奏总是有种仓促感
: 但这属于现实主义意淫小说，贴近生活，紧跟时事
: 看来最近更新不力，作者也在观望，你妹的.......
: 摘段搞笑
: "电视里放着新闻，又一名正部级领导被中纪委调查，刘汉东心中一亮，刘飞不过是副
: 省级市长，有个省委书记的岳父而已，他在近江乃至江东可以只手遮天，但他的手遮不
: 住中国，遮不住世界，康师傅这种级别的大佬都能拉下马，何况一个小小的省会市长，
: 对，就按照中央打老虎的经验，先把他的外围一个个的清理掉，相当于把老虎的爪子剁
: 掉，牙齿掰掉，最后把这只老虎打死"

m*c2011-03-04 08:03

9 楼

手机。

【在 w*****y 的大作中提到】

: 因为平时大部分时候都有wifi用，好几天都可以用不到3G的数据。
: 这样一来，要用3G的时候就连不上，只能关机重启。
: 试过打开airplane mode再关上，不管用:(
: 是我手机的问题还是att的问题呢？

j*x2011-03-04 08:03

10 楼

确实棘手。。。
如果在A已经几乎被100% knockdown的情况下无法观察到针对B的效应，那么A对B的调控
几乎可以被排除了，显然siRNA off-target效应是很可能的解释之一。
能不能不用siRNA pool，分别转染单个siRNA，看看能不能找出问题出来哪个siRNA上

m*82011-03-04 08:03

11 楼

后期得有人。邀请父母来吧。

b*c2011-03-04 08:03

12 楼

这个要看具体的人不看种族和肤色吧

【在 A********t 的大作中提到】

: 请指点.谢谢.

c*a2011-03-04 08:03

13 楼

这本书讲故事有一种张力，挺好。
至于真假，说实话，网络小说，哪个能经得起推敲？又不是内参。

s*g2011-03-04 08:03

14 楼

我好几次也不能用3g，不知道啥原因

★ 发自iPhone App: ChineseWeb - 中文网站浏览器

【在 w*****y 的大作中提到】

F*22011-03-04 08:03

15 楼

不管你们做siRNA, 还是shRNA, 不做rescue control吗？如果脱靶的话，你再
introduce wt A基因的话，B下调的phenotype是不能回复的

c*n2011-03-04 08:03

16 楼

你们学校的AVERAGE TEACHING EVALUATION多少分啊？如果是满分5分制的话？

让他

【在 z***i 的大作中提到】

: 是个teaching school。。。第一学期下来觉得压力一般，学生review都不错，就惦记
: 着生娃了（30了啊！），但和ld异地，东西海岸。。。每个月能见上10天吧（他公司让他
: work from home）。。。能生吗？过来人说说。。。。冷水热水都泼点吧。。。。。

T*u2011-03-04 08:03

17 楼

我见过的国人经理都还不错，白人经理阴险的多

w*n2011-03-04 08:03

18 楼

嗯，那不错，我去看看！

o*42011-03-04 08:03

19 楼

建议做rescue，看看B的表达在shRNA之后能不能恢复

【在 b**********8 的大作中提到】

: 小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
: 废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
: 一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
: 因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
: 胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
: 我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
: 老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
: siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
: 几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
: 从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来

a*h2011-03-04 08:03

20 楼

如果你父母很给力，自己觉得工作压力不大的话，可行。累是肯定的。

让他
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7

【在 z***i 的大作中提到】

T*u2011-03-04 08:03

21 楼

我见过的国人经理都还不错，白人经理阴险的多

w*n2011-03-04 08:03

22 楼

感觉不是四川就是云贵一代的作者，呵呵

b*82011-03-04 08:03

23 楼

多谢楼上各位的建议，rescue的实验我们确实还没做过。今天又想向大家反应点新情况
，如下：
当初shRNA敲除A的时候，B基因在mRNA和protein水平都有显著下调。如前文所述，包括
B基因启动子的报告基因实验，组蛋白乙酰化和甲基化修饰，DNA甲基化等都是阴性结果
。后来实在没办法了，和别的组里的人讨论了下，觉得是否有可能A通过维持B基因转录
产物的稳定性，于是我又做了这个实验，转染A基因的siRNA后，等待48小时，再向
medium中加入Actinomycin D,每隔4小时收集细胞提取RNA,分别收集0,4,8,12小时，每
次3个wells，然后做realtime RT-PCR，结果在两个细胞株中发现siRNA组细胞中B基因
mRNA降解的比siCONTROL更快，但是在另外两个细胞株里没有观察到这种分别。现在又
出现几个问题：
1）观察到分别得那两个细胞株里，48小时候（即加药的第0小时），A基因的knockdown
效率只有50%。而在另外两个没有分别的细胞株里，48小时的沉默效率却有80%，老板觉
得即使mRNA降解实验阳性，很有可能是artifact，认为我的数据不可信，然后又要我重
复。不过我发誓数据绝对是真实的，没有经过任何人为地modification。
2）因为当初观察到mRNA稳定性上的差别，所以老板让我做做B基因3'UTR的报告基因实
验，我把3'UTR克隆到pMir-Reporter vector的多克隆位点，然后转染细胞株，结果却
发现siRNA和siCONTROL相比没有分别。我想问，除了3'UTR，还有哪些因素影响mRNA的
稳定性呢？如果有，有分别可以做哪些实验验证呢？
不好意思，小弟不是生物学科班出身，以前是学临床的，出来读PhD也是曲线救国，很
多基础的东西不是太明白。另外我嘴笨，文笔不好，描述的可能有点乱，恳请大家给我
指点迷津，非常感谢~

z*i2011-03-04 08:03

24 楼

满分4分我第一学期是3.2左右吧。。。看学生评语都挺正面的，居然没有人骂。。。比
起以前博士教课的时候被骂得那个叫。。。。所以我满足了。。呵呵

【在 c**n 的大作中提到】

: 你们学校的AVERAGE TEACHING EVALUATION多少分啊？如果是满分5分制的话？
:
: 让他

T*u2011-03-04 08:03

25 楼

我见过的国人经理都还不错，白人经理阴险的多

w*n2011-03-04 08:03

26 楼

看了几回，得，变成好莱坞电影，中国剧情版了，整个一个Bourne 嘛，哈哈

y*u2011-03-04 08:03

27 楼

我是学工程+bioengineering，只是随便分析分析：
现在知道的是：
shRNA A knockdown = B 表达水平下降
siRNA A knockdown 100% = B 没影响
siRNA A knockdown 80% = B 没影响
siRNA A knockdown 50% = B 降解加速
如果rescue无法排除脱靶的话，
你试一试siRNA A knockdown 30%和10%，看看吧。。。

z*i2011-03-04 08:03

28 楼

父母就是现在给力。。。说过了60就不帮我带了。。。。汗，所以得抓紧啊。。现在身
体都很好，比同龄父母都要活泼好动。。。。

【在 a**********h 的大作中提到】

: 如果你父母很给力，自己觉得工作压力不大的话，可行。累是肯定的。
:
: 让他
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7

m*t2011-03-04 08:03

29 楼

都有好有坏。如果其它性格人品能力方面大致相同，我会选国人经理。因为如果
performence相同，同族毕竟更容易成为心腹。你反过来想，如果你是一个经理，组里
有两个能力都不错的组员，一个是国人，一个是白人/黑穆三，你会更倾向于培养哪个
做你的铁杆？

【在 A********t 的大作中提到】

: 请指点.谢谢.

b*o2011-03-04 08:03

30 楼

何出此言

【在 w******n 的大作中提到】

: 感觉不是四川就是云贵一代的作者，呵呵

h*42011-03-04 08:03

31 楼

没rescue出来之前不要做太多阿，这是最基本的control阿，
谁知道那么大量的shRNA会引起啥变化
难道你师姐前一篇快接受的文章没有这个rescue试验？

z*i2011-03-04 08:03

32 楼

还有就是不知道如果第二年就生，我教的课应该没有人可以帮代。。不知道系里意见会
不会大啊？还是美国人不care这个。。。。。

g*r2011-03-04 08:03

33 楼

难怪我们印度经理对印度下属特别上心，露脸的活儿都给他们干

p*a2011-03-04 08:03

34 楼

最近作者的文风变得油滑很多，搞笑很多
不太好判断他的地方
比方近江很象南京南昌这种地方，其实也是北方话

b*82011-03-04 08:03

35 楼

发信人: hffmsb4 (Hong), 信区: Biology
标题: Re: 大家有没有经历过这种情况？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Mar 5 02:33:15 2011, 美东)
没rescue出来之前不要做太多阿，这是最基本的control阿，
谁知道那么大量的shRNA会引起啥变化
难道你师姐前一篇快接受的文章没有这个rescue试验？
多谢你的建议，我们确实还没有做过这个rescue的实验。但是我现在最想知道的是，影
响mRNA stability的因素当中，除了3’UTR，还有那些因素，分别可以用什么实验方法
来验证，请各位献言献策吧。多谢了

c*n2011-03-04 08:03

36 楼

得看平均吧，我们这里有的系AVERAGE 4.6/5, 真是蛋疼啊！

【在 z***i 的大作中提到】

: 满分4分我第一学期是3.2左右吧。。。看学生评语都挺正面的，居然没有人骂。。。比
: 起以前博士教课的时候被骂得那个叫。。。。所以我满足了。。呵呵

t*t2011-03-04 08:03

37 楼

没错，然后那些杂七杂八的烂活急活都被丢给谁你也会看到。：）这也是为什么烙印能
做上去而老中不行的原因之一。

【在 g*********r 的大作中提到】

: 难怪我们印度经理对印度下属特别上心，露脸的活儿都给他们干

b*o2011-03-04 08:03

38 楼

这个看他以前的东西。直说了是徐州人

b*l2011-03-04 08:03

39 楼

正如大家说的，重点肯定还是 rescue 了，而且也不难做，有这折腾的时间说不定早就
做出来了。
不过我好奇哈：shRNA 是你师姐做的，但是你重复过没有？
另外，老板说 artifacts 不是说怀疑你 modify data。

【在 b**********8 的大作中提到】

D*Y2011-03-04 08:03

40 楼

学生看教授会给点面子的.

【在 z***i 的大作中提到】

e*p2011-03-04 08:03

41 楼

如果两个能力都不错，我会两个都培养，给相同的growth机会，看谁走得更远
但语言文化上的共鸣，我会跟国人更有共同语言，不经意间走得会更近，如果会引起组
员白人的妒忌或者其他想法，我会表面上可以跟国人保持距离，但我会跟国人下属讲清
楚，这并不减少他的机会，希望得到他的理解和支持。私下还是跟国人走的更近，无意
间也会给他更多的关注和培养

【在 m*****t 的大作中提到】

: 都有好有坏。如果其它性格人品能力方面大致相同，我会选国人经理。因为如果
: performence相同，同族毕竟更容易成为心腹。你反过来想，如果你是一个经理，组里
: 有两个能力都不错的组员，一个是国人，一个是白人/黑穆三，你会更倾向于培养哪个
: 做你的铁杆？

p*a2011-03-04 08:03

42 楼

kao，哥太英明了，你看我猜南京人，相距甚近阿，说话也是类似的

【在 b******o 的大作中提到】

: 这个看他以前的东西。直说了是徐州人

b*82011-03-04 08:03

43 楼

重复过的，我来之后也一直用shRNA处理细胞并陆续进行下游的一些实验。后来因为要
做ChIP,需要的shRNA量太大，我们都是自己包装纯化慢病毒的，不能满足我试验的需要
，索性就买了siRNA回来，在optimize条件的时候发现的这个问题。
那我想问下，这个rescue的实验该如何做呢？我们之前都是在转导慢病毒shRNA后第四
天收细胞进行各种实验的，对B基因的抑制可以在第3天到第7天观察得到，更短或者更
长的时间我们没做过。

【在 b*****l 的大作中提到】

: 正如大家说的，重点肯定还是 rescue 了，而且也不难做，有这折腾的时间说不定早就
: 做出来了。
: 不过我好奇哈：shRNA 是你师姐做的，但是你重复过没有？
: 另外，老板说 artifacts 不是说怀疑你 modify data。

w*g2011-03-04 08:03

44 楼

你现在生已经晚了。我30的时候都已经三个娃了。

让他

【在 z***i 的大作中提到】

b*d2011-03-04 08:03

45 楼

傻屄

【在 e**p 的大作中提到】

: 如果两个能力都不错，我会两个都培养，给相同的growth机会，看谁走得更远
: 但语言文化上的共鸣，我会跟国人更有共同语言，不经意间走得会更近，如果会引起组
: 员白人的妒忌或者其他想法，我会表面上可以跟国人保持距离，但我会跟国人下属讲清
: 楚，这并不减少他的机会，希望得到他的理解和支持。私下还是跟国人走的更近，无意
: 间也会给他更多的关注和培养

b*o2011-03-04 08:03

46 楼

等等哪位大江苏的同学指出你的错误。
有趣的是看他以前的东西的时候很多不同地方的人都觉得作者是自己地方的人。

【在 p********a 的大作中提到】

: kao，哥太英明了，你看我猜南京人，相距甚近阿，说话也是类似的

y*i2011-03-04 08:03

47 楼

这个主意不好。

【在 y******u 的大作中提到】

: 我是学工程+bioengineering，只是随便分析分析：
: 现在知道的是：
: shRNA A knockdown = B 表达水平下降
: siRNA A knockdown 100% = B 没影响
: siRNA A knockdown 80% = B 没影响
: siRNA A knockdown 50% = B 降解加速
: 如果rescue无法排除脱靶的话，
: 你试一试siRNA A knockdown 30%和10%，看看吧。。。

s*e2011-03-04 08:03

48 楼

你确实是跟faculty有仇。
30岁生娃不是很正常？

【在 w***g 的大作中提到】

: 你现在生已经晚了。我30的时候都已经三个娃了。
:
: 让他

e*p2011-03-04 08:03

49 楼

Please shut up your dirty mouth.

【在 b*******d 的大作中提到】

: 傻屄

p*a2011-03-04 08:03

50 楼

徐州肯定算苏北，江淮嘛
南京貌似江南，其实民风方言也是偏苏北，印象里。。。。。

【在 b******o 的大作中提到】

: 等等哪位大江苏的同学指出你的错误。
: 有趣的是看他以前的东西的时候很多不同地方的人都觉得作者是自己地方的人。

a*e2011-03-04 08:03

51 楼

design two shRNA, could you get the same phenotype?

n*r2011-03-04 08:03

52 楼

父母都能过来帮忙还好吧..
我再research school...LD现在还再国内呢...不过是临时的...平时也是LD，不过开车
半天能到...

让他

【在 z***i 的大作中提到】

s*d2011-03-04 08:03

53 楼

让版主关他小黑屋吧

【在 e**p 的大作中提到】

: Please shut up your dirty mouth.

b*82011-03-04 08:03

54 楼

当初确实设计了不同序列的两对shRNA,结果一样，只不过其中一对更为profound。这样
的话是不是可以排除shRNA的脱靶效应。
我后来比较了一下，两队shRNA分别target A基因的第1和第4个exon，后来买的
smartpool siRNA,其中两条也是target这两个exon，还有两条target 更靠近3'端，其
中好像有一条还target到3’UTR（记不清了），请问这个有什么影响吗？

【在 a***e 的大作中提到】

: design two shRNA, could you get the same phenotype?

a*h2011-03-04 08:03

55 楼

那就要把，基本上（不绝对）
只有后悔没生的，很少有后悔生了的
只有后悔生晚的，很少有后悔生早了的（碰上坏男人的另说）
只有后悔生少的，很少有后悔生多了的
恩

【在 z***i 的大作中提到】

: 父母就是现在给力。。。说过了60就不帮我带了。。。。汗，所以得抓紧啊。。现在身
: 体都很好，比同龄父母都要活泼好动。。。。

s*r2011-03-04 08:03

56 楼

我见过的国人经理都还不错
非常同意

b*l2011-03-04 08:03

57 楼

做过 A 的 k/o 么？

【在 b**********8 的大作中提到】

:
: 当初确实设计了不同序列的两对shRNA,结果一样，只不过其中一对更为profound。这样
: 的话是不是可以排除shRNA的脱靶效应。
: 我后来比较了一下，两队shRNA分别target A基因的第1和第4个exon，后来买的
: smartpool siRNA,其中两条也是target这两个exon，还有两条target 更靠近3'端，其
: 中好像有一条还target到3’UTR（记不清了），请问这个有什么影响吗？

z*i2011-03-04 08:03

58 楼

这个热水泼的好！！！！

【在 a**********h 的大作中提到】

: 那就要把，基本上（不绝对）
: 只有后悔没生的，很少有后悔生了的
: 只有后悔生晚的，很少有后悔生早了的（碰上坏男人的另说）
: 只有后悔生少的，很少有后悔生多了的
: 恩

s*h2011-03-04 08:03

59 楼

选帅的那个.

s*y2011-03-04 08:03

60 楼

听起来你其实已经作了很多工作了。
我建议你勤向老板汇报，不管是正面数据还是负面数据都应该向老板报告。
（除非是自己出了错跑错胶填错数据之类的错误，这种就要尽量不要让他知道）
对于负面数据，虚心的（或者是装着虚心的）向老板请教下一步该怎么做。
至于你们那个数据到底是怎么回事，我觉得脱靶是很有可能的，但是这个其实
并不会影响你们的那个项目，也应该不会影响你的师姐的文章，相反，万一
审稿者提出这个问题来的时候，你的数据就有用了。
我建议你把结果向老板报告，不要自己闷着头作。
我自己学习到的一点是：负面数据不一定都是坏事。

【在 b**********8 的大作中提到】

m*a2011-03-04 08:03

61 楼

http://www.nationmaster.com/graph/hea_age_of_wom_at_fir_chi-hea
30岁挺晚了

【在 s**********e 的大作中提到】

: 你确实是跟faculty有仇。
: 30岁生娃不是很正常？

m*i2011-03-04 08:03

62 楼

不管什么颜色，跟着leadership强的走。国人做经理，可能对国人比较nice。但国人
经理自己本身可能会受到玻璃天花板的限制，在上司哪里分量有限，那么他即使重用你
，也为你挣不到什么。所以，跟个强大的leader是关键。

d*u2011-03-04 08:03

63 楼

同学，先把rescue实验做了吧，这是最重要的。还有一点就是你怎么确定你自己的
siRNA产生的抑制不是off target的效应呢？

s*n2011-03-04 08:03

64 楼

A ton of people have kids in 30s in academia.
30 is young.
Go ahead and ignore the noise.

【在 m********a 的大作中提到】

: http://www.nationmaster.com/graph/hea_age_of_wom_at_fir_chi-hea
: 30岁挺晚了

h*e2011-03-04 08:03

65 楼

就是因为有你这种人，国人面试的时候也不愿意给国人放水，要找“最合心意的”。
知道国人不团结在哪了吧？国人上级不待见国人下级，国人下级也不吊国人上级。

【在 m*****i 的大作中提到】

: 不管什么颜色，跟着leadership强的走。国人做经理，可能对国人比较nice。但国人
: 经理自己本身可能会受到玻璃天花板的限制，在上司哪里分量有限，那么他即使重用你
: ，也为你挣不到什么。所以，跟个强大的leader是关键。

j*r2011-03-04 08:03

66 楼

如果楼主感兴趣，以后可以尝试make stable tet-on shRNA in the target cells。比
如novartis的tet-on pLKO，最近Steve Elledge也做了一个inducible shRNA vector (
based on miR30).

w*n2011-03-04 08:03

67 楼

想要优良种子跟我说一下！

M*n2011-03-04 08:03

68 楼

rescue是一种control.
楼主用不同的siRNA targeting同一个基因，也是一种control。
unfortunately this control did not give positive results.
therefore, the initial conclusion that the regulation of B is dependent on A
should be rejected at this point.

w*e2011-03-04 08:03

69 楼

这个统计实在没什么意思，这包括hispanic，african-american那些未婚先孕，10几岁
就生娃的。

【在 m********a 的大作中提到】

: http://www.nationmaster.com/graph/hea_age_of_wom_at_fir_chi-hea
: 30岁挺晚了

y*i2011-03-04 08:03

70 楼

"也应该不会影响你的师姐的文章" 怎么可能？

发现
个基
癌细
要由
了后
效率
果，
后来

【在 s******y 的大作中提到】

: 听起来你其实已经作了很多工作了。
: 我建议你勤向老板汇报，不管是正面数据还是负面数据都应该向老板报告。
: （除非是自己出了错跑错胶填错数据之类的错误，这种就要尽量不要让他知道）
: 对于负面数据，虚心的（或者是装着虚心的）向老板请教下一步该怎么做。
: 至于你们那个数据到底是怎么回事，我觉得脱靶是很有可能的，但是这个其实
: 并不会影响你们的那个项目，也应该不会影响你的师姐的文章，相反，万一
: 审稿者提出这个问题来的时候，你的数据就有用了。
: 我建议你把结果向老板报告，不要自己闷着头作。
: 我自己学习到的一点是：负面数据不一定都是坏事。

m*u2011-03-04 08:03

71 楼

I think that is possible, you need to plan it well though, for example,
having the baby during summer. Although that means you won't have a
maternity leave, but it will reduce your stress. Also, you can ask your
school to extend your tenure clock, generally for one year.

s*y2011-03-04 08:03

72 楼

等他的结果核实的时候，他的师姐的文章可能都已经出版了。
弄不好还能再发一篇文章，实验室自己更正自己的文章还是有先例的吧？

【在 y***i 的大作中提到】

: "也应该不会影响你的师姐的文章" 怎么可能？
:
: 发现
: 个基
: 癌细
: 要由
: 了后
: 效率
: 果，
: 后来

p*m2011-03-04 08:03

73 楼

要我说一个连rescue都没有的RNAi实验如果能过reviewer这关这杂志得有多水啊

【在 s******y 的大作中提到】

: 等他的结果核实的时候，他的师姐的文章可能都已经出版了。
: 弄不好还能再发一篇文章，实验室自己更正自己的文章还是有先例的吧？

s*y2011-03-04 08:03

74 楼

所以这个实验本来就是早晚都要做的嘛。
另外，你还真别说，我就看过好多篇没有rescue 的文章，我们做journal club
时不时就能读到这样的文章，而且还是JCB 以上的级别的。估计老板够牛，审稿
人不敢多嘴或者主编放水。
再另外，有些蛋白是很难做rescue的，因为弄进一个fusion 之后常常会出问题，
或者是没有料到5', 3'-UTR有些意料之外的功能，表达进去的recombinant 没有
办法fully rescue

【在 p*****m 的大作中提到】

: 要我说一个连rescue都没有的RNAi实验如果能过reviewer这关这杂志得有多水啊

p*m2011-03-04 08:03

75 楼

没rescue的话是不是至少得有个scrambled RNAi或者multiple targeting construct一
起用才行？其实按lz这个说法如果真是off target，当时多用几个shRNA的话应该就
能看出来吧
。

【在 s******y 的大作中提到】

: 所以这个实验本来就是早晚都要做的嘛。
: 另外，你还真别说，我就看过好多篇没有rescue 的文章，我们做journal club
: 时不时就能读到这样的文章，而且还是JCB 以上的级别的。估计老板够牛，审稿
: 人不敢多嘴或者主编放水。
: 再另外，有些蛋白是很难做rescue的，因为弄进一个fusion 之后常常会出问题，
: 或者是没有料到5', 3'-UTR有些意料之外的功能，表达进去的recombinant 没有
: 办法fully rescue

s*y2011-03-04 08:03

76 楼

scrambled RNAi一般是必须作的吧，而且很多时候那个是厂家配送的，一般人
会顺手就做了。
另外，看样子，他的师姐当时没有用足够多的不同的shRNA, 所以他现在用了
另外一个不同的shRNA mixture就得出了不同的结论。
但是，现在还有一个问题是，他自己用的shRNA mixture 未必就是最好的，
说不定是因为他用的那个mixture有off target, 才导致了他的结论不一样。
在这种情况下，我也赞成你们的意见，就是先做一个rescue试试看。

【在 p*****m 的大作中提到】

: 没rescue的话是不是至少得有个scrambled RNAi或者multiple targeting construct一
: 起用才行？其实按lz这个说法如果真是off target，当时多用几个shRNA的话应该就
: 能看出来吧
: 。

p*m2011-03-04 08:03

77 楼

他自己的当然不一定好但是问题是他的siRNA导致了A下调但是B没有反应。因此唯一
能解释原来model(A-->B)的可能就是他的siRNA mix一方面downregulate A，一方面
siRNA还有off-target effect，弄掉了某个B的regulatory gene，使得B没有显示出A下
降之后预期的变化。这个未免也太不可能了。。

【在 s******y 的大作中提到】

: scrambled RNAi一般是必须作的吧，而且很多时候那个是厂家配送的，一般人
: 会顺手就做了。
: 另外，看样子，他的师姐当时没有用足够多的不同的shRNA, 所以他现在用了
: 另外一个不同的shRNA mixture就得出了不同的结论。
: 但是，现在还有一个问题是，他自己用的shRNA mixture 未必就是最好的，
: 说不定是因为他用的那个mixture有off target, 才导致了他的结论不一样。
: 在这种情况下，我也赞成你们的意见，就是先做一个rescue试试看。

b*82011-03-04 08:03

78 楼

谢谢楼上各位的意见和建议，特别感谢sunnyday战友的意见，或许我和老板交流的确实
不够，每次只是简单地汇报下data，此物鲜有更深层次的交流，当然这也有我不善于表
达和交流的责任在里面，以后尽量争取做得更好些。另外，还要感谢juicemaker战友的
建议，如你所言，我们的确也已经在着手准备构建inducible shRNA expression
system，不过我们采用的是Clontech公司的pSingle-tTS-shRNA system，而且准备用这
个建立稳定克隆然后在小鼠体内进行相关实验。
扯远了，如前文所述，我现在发现siRNA 敲掉A基因后，在两个细胞株中都观察到B基因
半衰期有显著缩短，但是B基因3'UTR的luciferase报告基因实验却无差别。所以我现在
的问题是，假设A能增加B的转录产物的稳定性这一现象是真的，但是又不是通过3’UTR
这个环节的话，那么还有哪些环节可以考虑呢？分别可以用那些实验技术来验证呢？我
看了一些关于mRNA stability方面的文献，发现影响mRNA stability的因素太多了，这
样的话我的课题又陷入了一个新的寻找机制的汪洋大海，岂不悲哉？

b*l2011-03-04 08:03

79 楼

唉，也见过一些。读的时候不怀好意地想：肯定是 rescue 没成功。

【在 p*****m 的大作中提到】

: 要我说一个连rescue都没有的RNAi实验如果能过reviewer这关这杂志得有多水啊

b*82011-03-04 08:03

80 楼

多谢关注，我们每个实验都有同时使用scrambled control的

【在 p*****m 的大作中提到】

p*m2011-03-04 08:03

81 楼

multiple shRNA呢？

【在 b**********8 的大作中提到】

:
: 多谢关注，我们每个实验都有同时使用scrambled control的

b*l2011-03-04 08:03

82 楼

对了，忘了问了：shRNA k/d A 后，测没测过 A 和 B 的 mRNA 的稳定性？shRNA 要是
off-target 到了 B 上，也许可以看出来。

UTR

【在 b**********8 的大作中提到】

: 谢谢楼上各位的意见和建议，特别感谢sunnyday战友的意见，或许我和老板交流的确实
: 不够，每次只是简单地汇报下data，此物鲜有更深层次的交流，当然这也有我不善于表
: 达和交流的责任在里面，以后尽量争取做得更好些。另外，还要感谢juicemaker战友的
: 建议，如你所言，我们的确也已经在着手准备构建inducible shRNA expression
: system，不过我们采用的是Clontech公司的pSingle-tTS-shRNA system，而且准备用这
: 个建立稳定克隆然后在小鼠体内进行相关实验。
: 扯远了，如前文所述，我现在发现siRNA 敲掉A基因后，在两个细胞株中都观察到B基因
: 半衰期有显著缩短，但是B基因3'UTR的luciferase报告基因实验却无差别。所以我现在
: 的问题是，假设A能增加B的转录产物的稳定性这一现象是真的，但是又不是通过3’UTR
: 这个环节的话，那么还有哪些环节可以考虑呢？分别可以用那些实验技术来验证呢？我

b*82011-03-04 08:03

83 楼

不明白，什么是multiple shRNA?
我们以前用shRNA的时候一般这样分组：wt，shcontrol，shRNA1，shRNA2
现在用siRNA，只分三组，wt，scramble，siRNA

【在 p*****m 的大作中提到】

: multiple shRNA呢？

b*82011-03-04 08:03

84 楼

没有，后续的机制探索一直都用siRNA处理细胞，很久不再用shRNA了。有必要再用回
shRNA处理细胞再检测mRNA的半衰期吗？谢谢

【在 b*****l 的大作中提到】

: 对了，忘了问了：shRNA k/d A 后，测没测过 A 和 B 的 mRNA 的稳定性？shRNA 要是
: off-target 到了 B 上，也许可以看出来。
:
: UTR

b*l2011-03-04 08:03

85 楼

不麻烦的话就做做呗。。。估计 reviewer 也可能会让你们做。。。

【在 b**********8 的大作中提到】

:
: 没有，后续的机制探索一直都用siRNA处理细胞，很久不再用shRNA了。有必要再用回
: shRNA处理细胞再检测mRNA的半衰期吗？谢谢

s*y2011-03-04 08:03

86 楼

UTR
3'-UTR并不一定就是决定稳定性的所有因素，在一些情况下面，5'甚至ORF都有关系。
我虽然具体不是做这个的，但是，我觉得，你可以把那个 mRNA里面的ATG位点去掉
（这样它就不表达你们那个蛋白了），然后就可以把蛋白和 mRNA的效应分开了。

【在 b**********8 的大作中提到】

s*y2011-03-04 08:03

87 楼

这个不一定的，因为他们原先的模型( A -> B)过于简单了。其中说不定会涉及其他
因子，而其他因子说不定会受off target 的影响。
比方说，A-> c -> B, 如果c 受到影响，则整个链条不成立

【在 p*****m 的大作中提到】

: 他自己的当然不一定好但是问题是他的siRNA导致了A下调但是B没有反应。因此唯一
: 能解释原来model(A-->B)的可能就是他的siRNA mix一方面downregulate A，一方面
: siRNA还有off-target effect，弄掉了某个B的regulatory gene，使得B没有显示出A下
: 降之后预期的变化。这个未免也太不可能了。。