l*o
2 楼
本人的project中有个很重要的实验，是做药物对已知蛋白泛素化的影响。
先买了一个boston 公司ENZO的kits，拿着试剂盒中的阳性control，按照其说明书做，
神马阳性条带都没有见到，跟那个公司你来我往交流了一个多月，他们公司还继续给我
做了张漂亮的图，我这边换了个人做，还是啥泛素化条带都没有见到，我们实验室得出
的结论是试剂盒有问题。
接下来就换了家有口碑的boston biochem，买了p53 Ubiquitination Kit这个试剂盒，
说起来这种实验应该是很简单的，见了鬼了，依然是两个人做了两次还是阳性对照都出
不来。我觉得像这家公司试剂应该是问题不大的，但是我实在是找不到原因。
不知道有没有做过类似实验的版友给些好的建议，或者提醒我有什么tricks，或者再给
我推荐个用过的试剂盒。
谢谢！
先买了一个boston 公司ENZO的kits，拿着试剂盒中的阳性control，按照其说明书做，
神马阳性条带都没有见到，跟那个公司你来我往交流了一个多月，他们公司还继续给我
做了张漂亮的图，我这边换了个人做，还是啥泛素化条带都没有见到，我们实验室得出
的结论是试剂盒有问题。
接下来就换了家有口碑的boston biochem，买了p53 Ubiquitination Kit这个试剂盒，
说起来这种实验应该是很简单的，见了鬼了，依然是两个人做了两次还是阳性对照都出
不来。我觉得像这家公司试剂应该是问题不大的，但是我实在是找不到原因。
不知道有没有做过类似实验的版友给些好的建议，或者提醒我有什么tricks，或者再给
我推荐个用过的试剂盒。
谢谢！
z*n
3 楼
地毯掉毛，劣质产品，呵呵
常见于卖家临卖前装修所用
【在 c********s 的大作中提到】
: 新买的吸尘器，吸力超强。前天吸了一次地毯，trash tray里全是毛。
: 请问会不会把地毯吸坏？
: 谢谢
常见于卖家临卖前装修所用
【在 c********s 的大作中提到】
: 新买的吸尘器，吸力超强。前天吸了一次地毯，trash tray里全是毛。
: 请问会不会把地毯吸坏？
: 谢谢
l*o
4 楼
顶起求助！
c*s
5 楼
新房子，有warranty,请问要找builder吗？
谢谢
【在 z*********n 的大作中提到】
: 地毯掉毛，劣质产品，呵呵
: 常见于卖家临卖前装修所用
谢谢
【在 z*********n 的大作中提到】
: 地毯掉毛，劣质产品，呵呵
: 常见于卖家临卖前装修所用
s*y
6 楼
体外泛素化很难作的。即使是老手也容易出岔子，更不用说新手了。
不知道你们的kit 是否把所有component 都放进去了。
首先从最容易出岔子的地方来说吧，你们用什么检测方法？
如果用放射同位素标记的泛素还还容易看出带一些。
如果是用western blot的话，很难用蛋白本身的抗体直接看出ladder的。
我们一般都是把His-tagged 蛋白纯化之后再用anti-ubiquitin来看。
另外一个要点是，跑胶的时候最好要用4-15% gradient gel, 然后３０伏
转膜过夜。如果高压短时间转膜几乎转不出好看的带来。
【在 l****o 的大作中提到】
: 本人的project中有个很重要的实验，是做药物对已知蛋白泛素化的影响。
: 先买了一个boston 公司ENZO的kits，拿着试剂盒中的阳性control，按照其说明书做，
: 神马阳性条带都没有见到，跟那个公司你来我往交流了一个多月，他们公司还继续给我
: 做了张漂亮的图，我这边换了个人做，还是啥泛素化条带都没有见到，我们实验室得出
: 的结论是试剂盒有问题。
: 接下来就换了家有口碑的boston biochem，买了p53 Ubiquitination Kit这个试剂盒，
: 说起来这种实验应该是很简单的，见了鬼了，依然是两个人做了两次还是阳性对照都出
: 不来。我觉得像这家公司试剂应该是问题不大的，但是我实在是找不到原因。
: 不知道有没有做过类似实验的版友给些好的建议，或者提醒我有什么tricks，或者再给
: 我推荐个用过的试剂盒。
不知道你们的kit 是否把所有component 都放进去了。
首先从最容易出岔子的地方来说吧，你们用什么检测方法？
如果用放射同位素标记的泛素还还容易看出带一些。
如果是用western blot的话，很难用蛋白本身的抗体直接看出ladder的。
我们一般都是把His-tagged 蛋白纯化之后再用anti-ubiquitin来看。
另外一个要点是，跑胶的时候最好要用4-15% gradient gel, 然后３０伏
转膜过夜。如果高压短时间转膜几乎转不出好看的带来。
【在 l****o 的大作中提到】
: 本人的project中有个很重要的实验，是做药物对已知蛋白泛素化的影响。
: 先买了一个boston 公司ENZO的kits，拿着试剂盒中的阳性control，按照其说明书做，
: 神马阳性条带都没有见到，跟那个公司你来我往交流了一个多月，他们公司还继续给我
: 做了张漂亮的图，我这边换了个人做，还是啥泛素化条带都没有见到，我们实验室得出
: 的结论是试剂盒有问题。
: 接下来就换了家有口碑的boston biochem，买了p53 Ubiquitination Kit这个试剂盒，
: 说起来这种实验应该是很简单的，见了鬼了，依然是两个人做了两次还是阳性对照都出
: 不来。我觉得像这家公司试剂应该是问题不大的，但是我实在是找不到原因。
: 不知道有没有做过类似实验的版友给些好的建议，或者提醒我有什么tricks，或者再给
: 我推荐个用过的试剂盒。
r*g
7 楼
如果是新的地毯， 掉毛正常吧 - 特别如果是羊毛。
W*C
8 楼
我们不但目标蛋白是ｆｌａｇ ｔａｇ， ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ也加了ＨＡ ＴＡＧ。
按理说加了多个ｕｂｉ的蛋白会降解掉， 我看很多ｐｒｏｔｏｃｏｌ里也没抑制降解
， ｌａｄｄｅｒ还能出的很漂亮。。。
按理说加了多个ｕｂｉ的蛋白会降解掉， 我看很多ｐｒｏｔｏｃｏｌ里也没抑制降解
， ｌａｄｄｅｒ还能出的很漂亮。。。
c*s
9 楼
我再吸几次看看， 如果再有就去找builder。
谢谢
【在 r*****g 的大作中提到】
: 如果是新的地毯， 掉毛正常吧 - 特别如果是羊毛。
谢谢
【在 r*****g 的大作中提到】
: 如果是新的地毯， 掉毛正常吧 - 特别如果是羊毛。
s*y
10 楼
在体外作的时候常常不降解的。
在体内做的时候则需要加抑制剂。
。
【在 W****C 的大作中提到】
: 我们不但目标蛋白是ｆｌａｇ ｔａｇ， ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ也加了ＨＡ ＴＡＧ。
: 按理说加了多个ｕｂｉ的蛋白会降解掉， 我看很多ｐｒｏｔｏｃｏｌ里也没抑制降解
: ， ｌａｄｄｅｒ还能出的很漂亮。。。
在体内做的时候则需要加抑制剂。
。
【在 W****C 的大作中提到】
: 我们不但目标蛋白是ｆｌａｇ ｔａｇ， ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ也加了ＨＡ ＴＡＧ。
: 按理说加了多个ｕｂｉ的蛋白会降解掉， 我看很多ｐｒｏｔｏｃｏｌ里也没抑制降解
: ， ｌａｄｄｅｒ还能出的很漂亮。。。
a*s
11 楼
羊毛地毯没经过"pre-vacuum"掉毛很正常。吸吸就没有了。
e*s
12 楼
计划做类似的试验，还没开始。
为什么用蛋白本身的抗体很难直接看出Ladder来？
【在 s******y 的大作中提到】
: 体外泛素化很难作的。即使是老手也容易出岔子，更不用说新手了。
: 不知道你们的kit 是否把所有component 都放进去了。
: 首先从最容易出岔子的地方来说吧，你们用什么检测方法？
: 如果用放射同位素标记的泛素还还容易看出带一些。
: 如果是用western blot的话，很难用蛋白本身的抗体直接看出ladder的。
: 我们一般都是把His-tagged 蛋白纯化之后再用anti-ubiquitin来看。
: 另外一个要点是，跑胶的时候最好要用4-15% gradient gel, 然后３０伏
: 转膜过夜。如果高压短时间转膜几乎转不出好看的带来。
为什么用蛋白本身的抗体很难直接看出Ladder来？
【在 s******y 的大作中提到】
: 体外泛素化很难作的。即使是老手也容易出岔子，更不用说新手了。
: 不知道你们的kit 是否把所有component 都放进去了。
: 首先从最容易出岔子的地方来说吧，你们用什么检测方法？
: 如果用放射同位素标记的泛素还还容易看出带一些。
: 如果是用western blot的话，很难用蛋白本身的抗体直接看出ladder的。
: 我们一般都是把His-tagged 蛋白纯化之后再用anti-ubiquitin来看。
: 另外一个要点是，跑胶的时候最好要用4-15% gradient gel, 然后３０伏
: 转膜过夜。如果高压短时间转膜几乎转不出好看的带来。
n*i
13 楼
完全正常，地毯就是这样的啊。
s*y
14 楼
因为泛素化的蛋白只占总蛋白的一小部分。而且，有些时候，泛素化会妨碍
抗体对蛋白的识别
【在 e****s 的大作中提到】
: 计划做类似的试验，还没开始。
: 为什么用蛋白本身的抗体很难直接看出Ladder来？
抗体对蛋白的识别
【在 e****s 的大作中提到】
: 计划做类似的试验，还没开始。
: 为什么用蛋白本身的抗体很难直接看出Ladder来？
c*s
15 楼
看样子是以前的吸尘器太烂了。谢谢
l*o
16 楼
谢谢sunnyday，除了抗体以外的所有成分都是公司提供的。
我们没有用同位素的方法检测，用的是目标蛋白p53的抗体以及ubiquitin的抗体。
转膜条件倒是30v过夜，并且用的是公司推荐的一个适合大分子转膜的一个配方。
我们没有用同位素的方法检测，用的是目标蛋白p53的抗体以及ubiquitin的抗体。
转膜条件倒是30v过夜，并且用的是公司推荐的一个适合大分子转膜的一个配方。
S*l
17 楼
如果地毯的绒毛比较长，头上部分很容易被老式强力洗尘器卷掉，甚至会拉扯其他的部
分。注意买洗尘器的性能哦。
分。注意买洗尘器的性能哦。
a*g
18 楼
你再提供点实验过程和kit的具体信息。看不到ubiquitination，p53总看得到吧，是不
是level一点都没变？ubiquitin也是，总看得到free ubiquitin吧？
【在 l****o 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，除了抗体以外的所有成分都是公司提供的。
: 我们没有用同位素的方法检测，用的是目标蛋白p53的抗体以及ubiquitin的抗体。
: 转膜条件倒是30v过夜，并且用的是公司推荐的一个适合大分子转膜的一个配方。
是level一点都没变？ubiquitin也是，总看得到free ubiquitin吧？
【在 l****o 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，除了抗体以外的所有成分都是公司提供的。
: 我们没有用同位素的方法检测，用的是目标蛋白p53的抗体以及ubiquitin的抗体。
: 转膜条件倒是30v过夜，并且用的是公司推荐的一个适合大分子转膜的一个配方。
y*o
19 楼
错！ 新地毯shredding很正常。再好的地毯刚装上都这样。时间长了就没有了。
【在 z*********n 的大作中提到】
: 地毯掉毛，劣质产品，呵呵
: 常见于卖家临卖前装修所用
【在 z*********n 的大作中提到】
: 地毯掉毛，劣质产品，呵呵
: 常见于卖家临卖前装修所用
W*C
20 楼
体内你用ｍｇ１３２抑制多久？ 太久细胞估计就死啦
【在 s******y 的大作中提到】
: 在体外作的时候常常不降解的。
: 在体内做的时候则需要加抑制剂。
:
: 。
l*o
21 楼
我的实验用的是这个试剂盒（http://www.bostonbiochem.com/product/k-200）分组和说明书一样的。
用p53特异性抗体WB检测，条带清晰，但各组p53的水平没有明显变化，说明书上泛素化
组是明显下降的。free Ub是很清晰的。
谢谢。
【在 a******g 的大作中提到】
: 你再提供点实验过程和kit的具体信息。看不到ubiquitination，p53总看得到吧，是不
: 是level一点都没变？ubiquitin也是，总看得到free ubiquitin吧？
用p53特异性抗体WB检测，条带清晰，但各组p53的水平没有明显变化，说明书上泛素化
组是明显下降的。free Ub是很清晰的。
谢谢。
【在 a******g 的大作中提到】
: 你再提供点实验过程和kit的具体信息。看不到ubiquitination，p53总看得到吧，是不
: 是level一点都没变？ubiquitin也是，总看得到free ubiquitin吧？
l*o
22 楼
体内实验我也做过，呵呵，我用过MG132抑制过12小时以上的，浓度10微摩，细胞并没
有死。
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 体内你用ｍｇ１３２抑制多久？ 太久细胞估计就死啦
有死。
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 体内你用ｍｇ１３２抑制多久？ 太久细胞估计就死啦
s*y
23 楼
我一向都只加5~6个小时。
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 体内你用ｍｇ１３２抑制多久？ 太久细胞估计就死啦
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 体内你用ｍｇ１３２抑制多久？ 太久细胞估计就死啦
a*g
24 楼
我看了一下protocol，+/-ATP的条件你是怎么做到的？貌似kit components里面只有一
个reaction buffer。
另外你确保E1 E2 E3 ub还有p53都加了？
【在 l****o 的大作中提到】
: 我的实验用的是这个试剂盒（http://www.bostonbiochem.com/product/k-200）分组和说明书一样的。
: 用p53特异性抗体WB检测，条带清晰，但各组p53的水平没有明显变化，说明书上泛素化
: 组是明显下降的。free Ub是很清晰的。
: 谢谢。
个reaction buffer。
另外你确保E1 E2 E3 ub还有p53都加了？
【在 l****o 的大作中提到】
: 我的实验用的是这个试剂盒（http://www.bostonbiochem.com/product/k-200）分组和说明书一样的。
: 用p53特异性抗体WB检测，条带清晰，但各组p53的水平没有明显变化，说明书上泛素化
: 组是明显下降的。free Ub是很清晰的。
: 谢谢。
Z*N
25 楼
你加fresh ATP了没?
l*o
26 楼
没有加，buffer里面有的。
【在 Z*****N 的大作中提到】
: 你加fresh ATP了没?
【在 Z*****N 的大作中提到】
: 你加fresh ATP了没?
l*o
27 楼
所有成分当然是加了，呵呵。+/- ATP就是+/- reaction buffer.
【在 a******g 的大作中提到】
: 我看了一下protocol，+/-ATP的条件你是怎么做到的？貌似kit components里面只有一
: 个reaction buffer。
: 另外你确保E1 E2 E3 ub还有p53都加了？
【在 a******g 的大作中提到】
: 我看了一下protocol，+/-ATP的条件你是怎么做到的？貌似kit components里面只有一
: 个reaction buffer。
: 另外你确保E1 E2 E3 ub还有p53都加了？
a*g
28 楼
那这个就很诡异了，建议联系boston biochem
【在 l****o 的大作中提到】
: 所有成分当然是加了，呵呵。+/- ATP就是+/- reaction buffer.
【在 l****o 的大作中提到】
: 所有成分当然是加了，呵呵。+/- ATP就是+/- reaction buffer.
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