in vitro methylation# Biology - 生物学
g*e
1 楼
打算挑战烘培了，从来没做过，所以什么都不知道。能不能介绍一下需要买什么基本用
具？你们都在哪儿买的？
目前，我知道要买个筛子筛面粉，有没有推荐的？
还要买个hand mixer吧？
还有模具？
先谢谢了。
具？你们都在哪儿买的？
目前，我知道要买个筛子筛面粉，有没有推荐的？
还要买个hand mixer吧？
还有模具？
先谢谢了。
h*r
2 楼
于正和邱泽之间的事情大家都是知道的，邱泽的团队本来找了于正，想要让邱泽在于正
的剧中出演男三号，本来已经定下来了，于正也说过了，自己这个人，只会雪中送炭，
而邱泽现在这个样子大家也都知道是什么情况的，能够有戏可拍就已经很不错了。可是
，与此同时，邱泽凭借电影《谁先爱上他的》入围了金马奖的最佳影帝，又和于正说档
期调不过来，演不了了，于正觉得邱泽怕是认为自己快要拿金马奖了吧？
所以最后双方也是闹得有点难看，于正在微博中表示说艺人以德为先，可是，这句话说
出口后，大家就开始纷纷把目光投向了于正的艺人吴谨言，表示说，你说人家要以德为
先，为什么你们自己的艺人还会发生这样的事情呢？吴谨言当初不也是和央视的节目约
好了要做采访的吗？后来不也是因为种种个人原因而导致对方愤怒了吗？
直接在微博上点名批评了吴谨言，一个刚刚红了没有多长时间的女艺人，在这个时候得
罪央视，不管是有心还是无意，最后不也还是被批评了吗？虽然事后吴谨言和她的团队
也一直都在道歉，目前双方已经和解了。有很多和吴谨言有过接触的人都说吴谨言不是
耍大牌的人，所以这件事情自然而然就变成了吴谨言团队的错，吴谨言不知道这件事情。
那么，现在于正也是全程和邱泽的经纪人联系这件事情的，很有可能邱泽自己也不知道
啊，他不是也回应说自己还不是太了解这个情况吗？总而言之，于正在怼邱泽的时候，
也让大家再度提起了吴谨言耍大牌的事情，其实还是觉得吴谨言挺无辜的，本来她看上
去也不是那种人，可是这一次无辜被带出场，估计内心也是崩溃的吧？
不过，尽管闹得不可开交，但还是有人爆料说于正的新剧《鬓边不是海棠红》中的男三
号目前还是邱泽，双方还没有就这件事情协调好，于正临时找人的话也会有一丝丝的困
难，不知道最后会不会让他来出演这部剧？而吴谨言，和央视的事情不管真实情况到底
如何，反正这也已经是她的黑点了，希望哪一天能够和央视再度合作才能够消除这件事
情的影响吧。
你们觉得吴谨言和邱泽的事情，谁的性质更严重？
的剧中出演男三号，本来已经定下来了，于正也说过了，自己这个人，只会雪中送炭，
而邱泽现在这个样子大家也都知道是什么情况的，能够有戏可拍就已经很不错了。可是
，与此同时，邱泽凭借电影《谁先爱上他的》入围了金马奖的最佳影帝，又和于正说档
期调不过来，演不了了，于正觉得邱泽怕是认为自己快要拿金马奖了吧？
所以最后双方也是闹得有点难看，于正在微博中表示说艺人以德为先，可是，这句话说
出口后，大家就开始纷纷把目光投向了于正的艺人吴谨言，表示说，你说人家要以德为
先，为什么你们自己的艺人还会发生这样的事情呢？吴谨言当初不也是和央视的节目约
好了要做采访的吗？后来不也是因为种种个人原因而导致对方愤怒了吗？
直接在微博上点名批评了吴谨言，一个刚刚红了没有多长时间的女艺人，在这个时候得
罪央视，不管是有心还是无意，最后不也还是被批评了吗？虽然事后吴谨言和她的团队
也一直都在道歉，目前双方已经和解了。有很多和吴谨言有过接触的人都说吴谨言不是
耍大牌的人，所以这件事情自然而然就变成了吴谨言团队的错，吴谨言不知道这件事情。
那么，现在于正也是全程和邱泽的经纪人联系这件事情的，很有可能邱泽自己也不知道
啊，他不是也回应说自己还不是太了解这个情况吗？总而言之，于正在怼邱泽的时候，
也让大家再度提起了吴谨言耍大牌的事情，其实还是觉得吴谨言挺无辜的，本来她看上
去也不是那种人，可是这一次无辜被带出场，估计内心也是崩溃的吧？
不过，尽管闹得不可开交，但还是有人爆料说于正的新剧《鬓边不是海棠红》中的男三
号目前还是邱泽，双方还没有就这件事情协调好，于正临时找人的话也会有一丝丝的困
难，不知道最后会不会让他来出演这部剧？而吴谨言，和央视的事情不管真实情况到底
如何，反正这也已经是她的黑点了，希望哪一天能够和央视再度合作才能够消除这件事
情的影响吧。
你们觉得吴谨言和邱泽的事情，谁的性质更严重？
S*g
3 楼
昨天女友生日, 在家给她开了一个suprise party。 特去一家St. Honore Bakery （休
斯顿Bellaire Blvd的那一家) 买了个生日蛋糕。
很久以前去那里买过几次蛋糕, 都是又新鲜又好吃。 昨天去, 我选好一个后, 问店员
是不是fresh的, 他说今天刚做的, 我就买了。
晚上party上, 给女友点好蜡烛。大家一边唱歌, 女友一边blow。然后我负责切蛋糕，
有人一吃蛋糕说是酸的。嘴快的吃了好几口, 也都说是酸的。切到底, 才发现底部有很
多绿霉点。女友也吃了两口。
后来客人把卫生间给轮流占领了，呕吐声不断。虽然女友表面一直说没事, 但一直黑着
脸。本来我们打算昨晚第一次噗哧噗哧的。。。结果女友早早自己开车回家了。
我一晚上没睡好，1/3时间拉稀，1/4时间撸管儿，1/6时间泡买买提，1/8时间给女友拨
电话+留言。
女友一直不接电话。今天我该怎么办? 请献计献策, 多谢了啊。
斯顿Bellaire Blvd的那一家) 买了个生日蛋糕。
很久以前去那里买过几次蛋糕, 都是又新鲜又好吃。 昨天去, 我选好一个后, 问店员
是不是fresh的, 他说今天刚做的, 我就买了。
晚上party上, 给女友点好蜡烛。大家一边唱歌, 女友一边blow。然后我负责切蛋糕，
有人一吃蛋糕说是酸的。嘴快的吃了好几口, 也都说是酸的。切到底, 才发现底部有很
多绿霉点。女友也吃了两口。
后来客人把卫生间给轮流占领了，呕吐声不断。虽然女友表面一直说没事, 但一直黑着
脸。本来我们打算昨晚第一次噗哧噗哧的。。。结果女友早早自己开车回家了。
我一晚上没睡好，1/3时间拉稀，1/4时间撸管儿，1/6时间泡买买提，1/8时间给女友拨
电话+留言。
女友一直不接电话。今天我该怎么办? 请献计献策, 多谢了啊。
b*8
4 楼
我想了解一段启动子序列甲基化和非甲基化对基因转录的影响（已经证实经某处理
因素处理后该段DNA序列甲基化频率显著降低），已经成功构建了包含该段序列的荧光
素酶报告基因(PGL3 basic vector)，该如何继续下游实验？看到相关的paper，有的是
直接把质粒用 MSss I在体外甲基化修饰后纯化回收后进行转染，比如这两篇文章http://cancerres.aacrjournals.org/content/66/9/4566.full.pdf
http://cancerres.aacrjournals.org/content/61/11/4628.full.pdf
有的则是把特定的启动子序列切下来进行体外的MSss I甲基化修饰，然后重新连接
回原来的vector，把连接液纯化后直接转染，比如这篇paper，http://mcb.asm.org/cgi/reprint/26/22/8572.pdf。
个人觉得第二种方法更严谨。第一种方法虽然简单，但是整个质粒上负责luciferase最
终表达的元件很多，他们的甲基化可能会对实验结果形成干扰。第二种方法似乎更为合
理，但是我觉得有几个问题，首先。质粒连接产物纯化回收过程中是不是特别容易断裂
啊？第二，连接产物中应该还有不少自连克隆吧，这也会对实验有影响的吧？第三，连
接产物转染的时候如何定量？直接把纯化后的产物测OD260和 OD280？
请大家对以上两种方法进行评价，另外，请问还有没有其他思路和方法完成我这个实验
？
因素处理后该段DNA序列甲基化频率显著降低），已经成功构建了包含该段序列的荧光
素酶报告基因(PGL3 basic vector)，该如何继续下游实验？看到相关的paper，有的是
直接把质粒用 MSss I在体外甲基化修饰后纯化回收后进行转染，比如这两篇文章http://cancerres.aacrjournals.org/content/66/9/4566.full.pdf
http://cancerres.aacrjournals.org/content/61/11/4628.full.pdf
有的则是把特定的启动子序列切下来进行体外的MSss I甲基化修饰，然后重新连接
回原来的vector，把连接液纯化后直接转染，比如这篇paper，http://mcb.asm.org/cgi/reprint/26/22/8572.pdf。
个人觉得第二种方法更严谨。第一种方法虽然简单，但是整个质粒上负责luciferase最
终表达的元件很多，他们的甲基化可能会对实验结果形成干扰。第二种方法似乎更为合
理，但是我觉得有几个问题，首先。质粒连接产物纯化回收过程中是不是特别容易断裂
啊？第二，连接产物中应该还有不少自连克隆吧，这也会对实验有影响的吧？第三，连
接产物转染的时候如何定量？直接把纯化后的产物测OD260和 OD280？
请大家对以上两种方法进行评价，另外，请问还有没有其他思路和方法完成我这个实验
？
l*y
5 楼
推荐去看一些牛人的博客，从准备工具开始，到基本的打发蛋白，到怎么做蛋糕面包，
都有很详细的介绍。
比如君之的博客：http://blog.sina.com.cn/junsmore
【在 g*******e 的大作中提到】
: 打算挑战烘培了，从来没做过，所以什么都不知道。能不能介绍一下需要买什么基本用
: 具？你们都在哪儿买的？
: 目前，我知道要买个筛子筛面粉，有没有推荐的？
: 还要买个hand mixer吧？
: 还有模具？
: 先谢谢了。
都有很详细的介绍。
比如君之的博客：http://blog.sina.com.cn/junsmore
【在 g*******e 的大作中提到】
: 打算挑战烘培了，从来没做过，所以什么都不知道。能不能介绍一下需要买什么基本用
: 具？你们都在哪儿买的？
: 目前，我知道要买个筛子筛面粉，有没有推荐的？
: 还要买个hand mixer吧？
: 还有模具？
: 先谢谢了。
x*t
6 楼
见上贴，爱若卑微就算了
【在 S*********g 的大作中提到】
: 昨天女友生日, 在家给她开了一个suprise party。 特去一家St. Honore Bakery （休
: 斯顿Bellaire Blvd的那一家) 买了个生日蛋糕。
: 很久以前去那里买过几次蛋糕, 都是又新鲜又好吃。 昨天去, 我选好一个后, 问店员
: 是不是fresh的, 他说今天刚做的, 我就买了。
: 晚上party上, 给女友点好蜡烛。大家一边唱歌, 女友一边blow。然后我负责切蛋糕，
: 有人一吃蛋糕说是酸的。嘴快的吃了好几口, 也都说是酸的。切到底, 才发现底部有很
: 多绿霉点。女友也吃了两口。
: 后来客人把卫生间给轮流占领了，呕吐声不断。虽然女友表面一直说没事, 但一直黑着
: 脸。本来我们打算昨晚第一次噗哧噗哧的。。。结果女友早早自己开车回家了。
: 我一晚上没睡好，1/3时间拉稀，1/4时间撸管儿，1/6时间泡买买提，1/8时间给女友拨
【在 S*********g 的大作中提到】
: 昨天女友生日, 在家给她开了一个suprise party。 特去一家St. Honore Bakery （休
: 斯顿Bellaire Blvd的那一家) 买了个生日蛋糕。
: 很久以前去那里买过几次蛋糕, 都是又新鲜又好吃。 昨天去, 我选好一个后, 问店员
: 是不是fresh的, 他说今天刚做的, 我就买了。
: 晚上party上, 给女友点好蜡烛。大家一边唱歌, 女友一边blow。然后我负责切蛋糕，
: 有人一吃蛋糕说是酸的。嘴快的吃了好几口, 也都说是酸的。切到底, 才发现底部有很
: 多绿霉点。女友也吃了两口。
: 后来客人把卫生间给轮流占领了，呕吐声不断。虽然女友表面一直说没事, 但一直黑着
: 脸。本来我们打算昨晚第一次噗哧噗哧的。。。结果女友早早自己开车回家了。
: 我一晚上没睡好，1/3时间拉稀，1/4时间撸管儿，1/6时间泡买买提，1/8时间给女友拨
b*8
7 楼
up
g*e
8 楼
谢谢啊。果然介绍的很详细。就是有些工具不知道对应的英文是什么。你们都在哪儿买
的？
【在 l*****y 的大作中提到】
: 推荐去看一些牛人的博客，从准备工具开始，到基本的打发蛋白，到怎么做蛋糕面包，
: 都有很详细的介绍。
: 比如君之的博客：http://blog.sina.com.cn/junsmore
的？
【在 l*****y 的大作中提到】
: 推荐去看一些牛人的博客，从准备工具开始，到基本的打发蛋白，到怎么做蛋糕面包，
: 都有很详细的介绍。
: 比如君之的博客：http://blog.sina.com.cn/junsmore
t*n
9 楼
久仰lz大名
……滔滔江水，
……绵绵不绝。
……滔滔江水，
……绵绵不绝。
s*s
10 楼
第一种太糙了，估计其他抗性啥的都不表达了。
你为什么不去问paper的author
【在 b**********8 的大作中提到】
: up
你为什么不去问paper的author
【在 b**********8 的大作中提到】
: up
l*y
11 楼
带英文的可以看这个：http://www.euphocafe.com/guide/guide.html
不过这个姐姐的工具太全了，刚开始用不着这么多。
我觉得最最基本的就是量杯，量勺，hand mixer，厨房秤，橡皮刮刀，深一点的圆形烤
盘，最好是不防粘的可以脱模的，烤面包的需要一个长方形的烤盘。
量杯量勺刮刀dollar店就能买到。
烤盘可以在amazon上找找，Michael's，kohl's有时候能找到便宜的。
hand mixer，厨房秤一般超市都有。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 谢谢啊。果然介绍的很详细。就是有些工具不知道对应的英文是什么。你们都在哪儿买
: 的？
不过这个姐姐的工具太全了，刚开始用不着这么多。
我觉得最最基本的就是量杯，量勺，hand mixer，厨房秤，橡皮刮刀，深一点的圆形烤
盘，最好是不防粘的可以脱模的，烤面包的需要一个长方形的烤盘。
量杯量勺刮刀dollar店就能买到。
烤盘可以在amazon上找找，Michael's，kohl's有时候能找到便宜的。
hand mixer，厨房秤一般超市都有。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 谢谢啊。果然介绍的很详细。就是有些工具不知道对应的英文是什么。你们都在哪儿买
: 的？
t*s
12 楼
女友当众给你blow吗
【在 S*********g 的大作中提到】
: 昨天女友生日, 在家给她开了一个suprise party。 特去一家St. Honore Bakery （休
: 斯顿Bellaire Blvd的那一家) 买了个生日蛋糕。
: 很久以前去那里买过几次蛋糕, 都是又新鲜又好吃。 昨天去, 我选好一个后, 问店员
: 是不是fresh的, 他说今天刚做的, 我就买了。
: 晚上party上, 给女友点好蜡烛。大家一边唱歌, 女友一边blow。然后我负责切蛋糕，
: 有人一吃蛋糕说是酸的。嘴快的吃了好几口, 也都说是酸的。切到底, 才发现底部有很
: 多绿霉点。女友也吃了两口。
: 后来客人把卫生间给轮流占领了，呕吐声不断。虽然女友表面一直说没事, 但一直黑着
: 脸。本来我们打算昨晚第一次噗哧噗哧的。。。结果女友早早自己开车回家了。
: 我一晚上没睡好，1/3时间拉稀，1/4时间撸管儿，1/6时间泡买买提，1/8时间给女友拨
d*i
13 楼
我们用的就是第一种方法，蛮好的，我没觉得有什么问题。因为就算是这个plasmid的
所有sequence都被methylated了也无所谓，转到细胞内以后只关心我的promoter和
luciferase的转录表达，其余backbone上的序列不要也无所谓，有没有转录表达没关系
。再说你肯定要做一个control。
第二种方法看上去确实是更严谨，但是我个人认为和luciferase转录表达有关的，来自
plasmid的只有promoter和后面的polyA了，不一定对啊。
如果你实在不放心可以去要这个质粒：(pCpGl-basic)。backbone上都是修饰过的没有
潜在methylation位点的。整个plasmid拿来做in vitro methylation对backbone没有影
响。
http://www.ag-rehli.de/materials.htm#pCpGL
所有sequence都被methylated了也无所谓，转到细胞内以后只关心我的promoter和
luciferase的转录表达，其余backbone上的序列不要也无所谓，有没有转录表达没关系
。再说你肯定要做一个control。
第二种方法看上去确实是更严谨，但是我个人认为和luciferase转录表达有关的，来自
plasmid的只有promoter和后面的polyA了，不一定对啊。
如果你实在不放心可以去要这个质粒：(pCpGl-basic)。backbone上都是修饰过的没有
潜在methylation位点的。整个plasmid拿来做in vitro methylation对backbone没有影
响。
http://www.ag-rehli.de/materials.htm#pCpGL
g*e
14 楼
多谢lisa，不过那位君之好象是个弟弟啊。
还有看别人写的方子，什么低筋粉，高筋粉，玉米粉之类的，在哪儿买的啊？我家只有
all purpose面粉啊。
【在 l*****y 的大作中提到】
: 带英文的可以看这个：http://www.euphocafe.com/guide/guide.html
: 不过这个姐姐的工具太全了，刚开始用不着这么多。
: 我觉得最最基本的就是量杯，量勺，hand mixer，厨房秤，橡皮刮刀，深一点的圆形烤
: 盘，最好是不防粘的可以脱模的，烤面包的需要一个长方形的烤盘。
: 量杯量勺刮刀dollar店就能买到。
: 烤盘可以在amazon上找找，Michael's，kohl's有时候能找到便宜的。
: hand mixer，厨房秤一般超市都有。
还有看别人写的方子，什么低筋粉，高筋粉，玉米粉之类的，在哪儿买的啊？我家只有
all purpose面粉啊。
【在 l*****y 的大作中提到】
: 带英文的可以看这个：http://www.euphocafe.com/guide/guide.html
: 不过这个姐姐的工具太全了，刚开始用不着这么多。
: 我觉得最最基本的就是量杯，量勺，hand mixer，厨房秤，橡皮刮刀，深一点的圆形烤
: 盘，最好是不防粘的可以脱模的，烤面包的需要一个长方形的烤盘。
: 量杯量勺刮刀dollar店就能买到。
: 烤盘可以在amazon上找找，Michael's，kohl's有时候能找到便宜的。
: hand mixer，厨房秤一般超市都有。
b*8
15 楼
体外甲基化修饰后的质粒是直接用来转染细胞的，不用做转化和质粒抽提，应该不用考
虑抗性丢失的问题了吧？ Anyway， thanks a lot！
【在 s******s 的大作中提到】
: 第一种太糙了，估计其他抗性啥的都不表达了。
: 你为什么不去问paper的author
虑抗性丢失的问题了吧？ Anyway， thanks a lot！
【在 s******s 的大作中提到】
: 第一种太糙了，估计其他抗性啥的都不表达了。
: 你为什么不去问paper的author
l*y
16 楼
君之是个很牛的弟弟。。
爱厨是个很牛的姐姐。。
做蛋糕一般用低筋粉，在超市买蛋糕用品的地方找纸盒装的cake flour就对，高筋粉一
般做面包，bread flour，应该跟all purpose放在一起。玉米粉就是corn starch，玉
米淀粉。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 多谢lisa，不过那位君之好象是个弟弟啊。
: 还有看别人写的方子，什么低筋粉，高筋粉，玉米粉之类的，在哪儿买的啊？我家只有
: all purpose面粉啊。
爱厨是个很牛的姐姐。。
做蛋糕一般用低筋粉，在超市买蛋糕用品的地方找纸盒装的cake flour就对，高筋粉一
般做面包，bread flour，应该跟all purpose放在一起。玉米粉就是corn starch，玉
米淀粉。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 多谢lisa，不过那位君之好象是个弟弟啊。
: 还有看别人写的方子，什么低筋粉，高筋粉，玉米粉之类的，在哪儿买的啊？我家只有
: all purpose面粉啊。
b*8
17 楼
多谢回复，你提供的信息对我实在太有用了，thanks a lot
【在 d****i 的大作中提到】
: 我们用的就是第一种方法，蛮好的，我没觉得有什么问题。因为就算是这个plasmid的
: 所有sequence都被methylated了也无所谓，转到细胞内以后只关心我的promoter和
: luciferase的转录表达，其余backbone上的序列不要也无所谓，有没有转录表达没关系
: 。再说你肯定要做一个control。
: 第二种方法看上去确实是更严谨，但是我个人认为和luciferase转录表达有关的，来自
: plasmid的只有promoter和后面的polyA了，不一定对啊。
: 如果你实在不放心可以去要这个质粒：(pCpGl-basic)。backbone上都是修饰过的没有
: 潜在methylation位点的。整个plasmid拿来做in vitro methylation对backbone没有影
: 响。
: http://www.ag-rehli.de/materials.htm#pCpGL
【在 d****i 的大作中提到】
: 我们用的就是第一种方法，蛮好的，我没觉得有什么问题。因为就算是这个plasmid的
: 所有sequence都被methylated了也无所谓，转到细胞内以后只关心我的promoter和
: luciferase的转录表达，其余backbone上的序列不要也无所谓，有没有转录表达没关系
: 。再说你肯定要做一个control。
: 第二种方法看上去确实是更严谨，但是我个人认为和luciferase转录表达有关的，来自
: plasmid的只有promoter和后面的polyA了，不一定对啊。
: 如果你实在不放心可以去要这个质粒：(pCpGl-basic)。backbone上都是修饰过的没有
: 潜在methylation位点的。整个plasmid拿来做in vitro methylation对backbone没有影
: 响。
: http://www.ag-rehli.de/materials.htm#pCpGL
m*V
18 楼
你最好先选定一个方子，再根据方子来买东西。烘焙可能用到的东西太多了，这么泛泛
地问，怎么买都会漏掉一点儿的。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 打算挑战烘培了，从来没做过，所以什么都不知道。能不能介绍一下需要买什么基本用
: 具？你们都在哪儿买的？
: 目前，我知道要买个筛子筛面粉，有没有推荐的？
: 还要买个hand mixer吧？
: 还有模具？
: 先谢谢了。
地问，怎么买都会漏掉一点儿的。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 打算挑战烘培了，从来没做过，所以什么都不知道。能不能介绍一下需要买什么基本用
: 具？你们都在哪儿买的？
: 目前，我知道要买个筛子筛面粉，有没有推荐的？
: 还要买个hand mixer吧？
: 还有模具？
: 先谢谢了。
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