Redian新闻
>
一个蛋白,染色可以,western检测不出来是怎么回事
avatar
一个蛋白,染色可以,western检测不出来是怎么回事# Biology - 生物学
h*n
1
公司帮忙申的签证,所以自己没法Track H1B的状态.
今天突然收到老婆H4的批准通知,可是律师还没告知我H1B的状态.
应该没问题了吧?
avatar
l*n
3
小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织,用western 检测不出来是怎么
回事呢?
我用kit 提的总蛋白,取了肝啊啥的几个器官,western上样100ug/lane.应该足够了。
另外谁能推荐一个好的HA 抗体,我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
多谢!
avatar
g*y
4
不清楚,理论上讲应该是的。只有楼主的H1B批准了,老婆的H4才成立吧~
avatar
a*n
5
推荐cell signaling 的HA

【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织,用western 检测不出来是怎么
: 回事呢?
: 我用kit 提的总蛋白,取了肝啊啥的几个器官,western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体,我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢!

avatar
b*s
6
我一直都是用的roche 12CA5,WB 和IP都用过,非常灵敏
你的免疫染色有阳性和阴性对照吗?做WB看不到结果的时候也应该和阳性对照一起跑。
IFA常常有假阳性,一定要有control

【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织,用western 检测不出来是怎么
: 回事呢?
: 我用kit 提的总蛋白,取了肝啊啥的几个器官,western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体,我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢!

avatar
l*n
7
谢谢楼上的,有阳性对照,我再琢磨琢磨
avatar
s*s
8
会不会不溶?你直接用sample buffer试一下

【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织,用western 检测不出来是怎么
: 回事呢?
: 我用kit 提的总蛋白,取了肝啊啥的几个器官,western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体,我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢!

avatar
b*s
9
不溶或者只是部分溶解的话蛋白部分保留结构,如果IFA能检测到,说明当蛋白保持二
级或者三级结构的时候还是可以被抗体识别的。如果他的sample还保留在buffer里的话
应该是可以被检测到的。
buffer里加了足够的protease inhibitor吗?cell lysate在什么条件下准备的?要排
除蛋白在准备过程中被分解的可能性。膜上看到分子量比较小的片断吗?也可以用
comassie blue染一下跑过的胶看看.WB做不出结果有太多可能性了

【在 s******s 的大作中提到】
: 会不会不溶?你直接用sample buffer试一下
avatar
y*8
10
Akt should be fairly easy to be detected by WB. What is your specific tissue
? You might need extra amount of protease inhibitor for some tissues.
avatar
l*n
11
谢楼上各位。蛋白是血管平滑肌特异性akt.SM22-HA-AKT,加了一个tag的话是90kd,
endogenous是50多,两个能区分。
分离蛋白是匀浆3次,用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
peotease, phosphatase inhibitor mix。
上western, 用cell signalling的抗体,磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有,
endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确,
确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低,我就不知道有多低
avatar
l*n
12
比较搞笑的是,这个课题的名称是----过表达akt对血管的影响。连endogenous 都出来
了他这个transgene还没出来,还啥过表达啊,所以对红旗到底能打多久表示失望。怕
做不出啥来。
avatar
l*n
13
第一次比较偷懒,就取了aorta, liver and skeletal muscle, three organs.

tissue

【在 y******8 的大作中提到】
: Akt should be fairly easy to be detected by WB. What is your specific tissue
: ? You might need extra amount of protease inhibitor for some tissues.

avatar
r*e
14
内源性的50kd带出来了?Akt检测还是很简单的,至少在细胞株里。

【在 l******n 的大作中提到】
: 谢楼上各位。蛋白是血管平滑肌特异性akt.SM22-HA-AKT,加了一个tag的话是90kd,
: endogenous是50多,两个能区分。
: 分离蛋白是匀浆3次,用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
: peotease, phosphatase inhibitor mix。
: 上western, 用cell signalling的抗体,磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有,
: endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
: 因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确,
: 确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低,我就不知道有多低

avatar
y*8
15
Well, transgene could be very low-expression. The HA IF signal should be
specific, because the signal is highly focused in a small subcellular region
. Once you break the tissue, the Akt is diluted. In addition, Akt could get
degraded quickly, especially in the case of constitutive active Akt.

【在 l******n 的大作中提到】
: 谢楼上各位。蛋白是血管平滑肌特异性akt.SM22-HA-AKT,加了一个tag的话是90kd,
: endogenous是50多,两个能区分。
: 分离蛋白是匀浆3次,用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
: peotease, phosphatase inhibitor mix。
: 上western, 用cell signalling的抗体,磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有,
: endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
: 因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确,
: 确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低,我就不知道有多低

相关阅读
logo
联系我们隐私协议©2024 redian.news
Redian新闻
Redian.news刊载任何文章,不代表同意其说法或描述,仅为提供更多信息,也不构成任何建议。文章信息的合法性及真实性由其作者负责,与Redian.news及其运营公司无关。欢迎投稿,如发现稿件侵权,或作者不愿在本网发表文章,请版权拥有者通知本网处理。