一个蛋白，染色可以，western检测不出来是怎么回事# Biology - 生物学
h*n
1 楼
公司帮忙申的签证,所以自己没法Track H1B的状态.
今天突然收到老婆H4的批准通知,可是律师还没告知我H1B的状态.
应该没问题了吧?
今天突然收到老婆H4的批准通知,可是律师还没告知我H1B的状态.
应该没问题了吧?
r*y
2 楼
貌似是 virginia mobile的广告,找了个假的tmobile小妞....说我们家的更好 貌似这
个意思
貌似是这个
http://mashable.com/2011/08/08/virgin-mobile-ad-t-mobile/
个意思
貌似是这个
http://mashable.com/2011/08/08/virgin-mobile-ad-t-mobile/
l*n
3 楼
小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织，用western 检测不出来是怎么
回事呢？
我用kit 提的总蛋白，取了肝啊啥的几个器官，western上样100ug/lane.应该足够了。
另外谁能推荐一个好的HA 抗体，我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
多谢！
疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织，用western 检测不出来是怎么
回事呢？
我用kit 提的总蛋白，取了肝啊啥的几个器官，western上样100ug/lane.应该足够了。
另外谁能推荐一个好的HA 抗体，我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
多谢！
g*y
4 楼
不清楚，理论上讲应该是的。只有楼主的H1B批准了，老婆的H4才成立吧～
a*n
5 楼
推荐cell signaling 的HA
【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织，用western 检测不出来是怎么
: 回事呢？
: 我用kit 提的总蛋白，取了肝啊啥的几个器官，western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体，我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢！
【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织，用western 检测不出来是怎么
: 回事呢？
: 我用kit 提的总蛋白，取了肝啊啥的几个器官，western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体，我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢！
b*s
6 楼
我一直都是用的roche 12CA5,WB 和IP都用过，非常灵敏
你的免疫染色有阳性和阴性对照吗？做WB看不到结果的时候也应该和阳性对照一起跑。
IFA常常有假阳性，一定要有control
【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织，用western 检测不出来是怎么
: 回事呢？
: 我用kit 提的总蛋白，取了肝啊啥的几个器官，western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体，我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢！
你的免疫染色有阳性和阴性对照吗？做WB看不到结果的时候也应该和阳性对照一起跑。
IFA常常有假阳性，一定要有control
【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织，用western 检测不出来是怎么
: 回事呢？
: 我用kit 提的总蛋白，取了肝啊啥的几个器官，western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体，我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢！
l*n
7 楼
谢谢楼上的，有阳性对照，我再琢磨琢磨
s*s
8 楼
会不会不溶？你直接用sample buffer试一下
【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织，用western 检测不出来是怎么
: 回事呢？
: 我用kit 提的总蛋白，取了肝啊啥的几个器官，western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体，我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢！
【在 l******n 的大作中提到】
: 小老板最近做了一个tissue specific expression of AKT mice.上面还连了一个HA.免
: 疫染色跟wt比较能看出挺大差别。但是我提了各个组织，用western 检测不出来是怎么
: 回事呢？
: 我用kit 提的总蛋白，取了肝啊啥的几个器官，western上样100ug/lane.应该足够了。
: 另外谁能推荐一个好的HA 抗体，我用了sigma H9658和roche 12CA5,感觉都一般。
: 多谢！
b*s
9 楼
不溶或者只是部分溶解的话蛋白部分保留结构，如果IFA能检测到，说明当蛋白保持二
级或者三级结构的时候还是可以被抗体识别的。如果他的sample还保留在buffer里的话
应该是可以被检测到的。
buffer里加了足够的protease inhibitor吗？cell lysate在什么条件下准备的？要排
除蛋白在准备过程中被分解的可能性。膜上看到分子量比较小的片断吗？也可以用
comassie blue染一下跑过的胶看看.WB做不出结果有太多可能性了
【在 s******s 的大作中提到】
: 会不会不溶？你直接用sample buffer试一下
级或者三级结构的时候还是可以被抗体识别的。如果他的sample还保留在buffer里的话
应该是可以被检测到的。
buffer里加了足够的protease inhibitor吗？cell lysate在什么条件下准备的？要排
除蛋白在准备过程中被分解的可能性。膜上看到分子量比较小的片断吗？也可以用
comassie blue染一下跑过的胶看看.WB做不出结果有太多可能性了
【在 s******s 的大作中提到】
: 会不会不溶？你直接用sample buffer试一下
y*8
10 楼
Akt should be fairly easy to be detected by WB. What is your specific tissue
? You might need extra amount of protease inhibitor for some tissues.
? You might need extra amount of protease inhibitor for some tissues.
l*n
11 楼
谢楼上各位。蛋白是血管平滑肌特异性akt.SM22-HA-AKT,加了一个tag的话是90kd,
endogenous是50多，两个能区分。
分离蛋白是匀浆3次，用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
peotease, phosphatase inhibitor mix。
上western, 用cell signalling的抗体，磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有，
endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确，
确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低，我就不知道有多低
endogenous是50多，两个能区分。
分离蛋白是匀浆3次，用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
peotease, phosphatase inhibitor mix。
上western, 用cell signalling的抗体，磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有，
endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确，
确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低，我就不知道有多低
l*n
12 楼
比较搞笑的是，这个课题的名称是----过表达akt对血管的影响。连endogenous 都出来
了他这个transgene还没出来，还啥过表达啊，所以对红旗到底能打多久表示失望。怕
做不出啥来。
了他这个transgene还没出来，还啥过表达啊，所以对红旗到底能打多久表示失望。怕
做不出啥来。
l*n
13 楼
第一次比较偷懒，就取了aorta, liver and skeletal muscle, three organs.
tissue
【在 y******8 的大作中提到】
: Akt should be fairly easy to be detected by WB. What is your specific tissue
: ? You might need extra amount of protease inhibitor for some tissues.
tissue
【在 y******8 的大作中提到】
: Akt should be fairly easy to be detected by WB. What is your specific tissue
: ? You might need extra amount of protease inhibitor for some tissues.
r*e
14 楼
内源性的50kd带出来了？Akt检测还是很简单的，至少在细胞株里。
【在 l******n 的大作中提到】
: 谢楼上各位。蛋白是血管平滑肌特异性akt.SM22-HA-AKT,加了一个tag的话是90kd,
: endogenous是50多，两个能区分。
: 分离蛋白是匀浆3次，用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
: peotease, phosphatase inhibitor mix。
: 上western, 用cell signalling的抗体，磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有，
: endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
: 因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确，
: 确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低，我就不知道有多低
【在 l******n 的大作中提到】
: 谢楼上各位。蛋白是血管平滑肌特异性akt.SM22-HA-AKT,加了一个tag的话是90kd,
: endogenous是50多，两个能区分。
: 分离蛋白是匀浆3次，用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
: peotease, phosphatase inhibitor mix。
: 上western, 用cell signalling的抗体，磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有，
: endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
: 因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确，
: 确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低，我就不知道有多低
y*8
15 楼
Well, transgene could be very low-expression. The HA IF signal should be
specific, because the signal is highly focused in a small subcellular region
. Once you break the tissue, the Akt is diluted. In addition, Akt could get
degraded quickly, especially in the case of constitutive active Akt.
【在 l******n 的大作中提到】
: 谢楼上各位。蛋白是血管平滑肌特异性akt.SM22-HA-AKT,加了一个tag的话是90kd,
: endogenous是50多，两个能区分。
: 分离蛋白是匀浆3次，用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
: peotease, phosphatase inhibitor mix。
: 上western, 用cell signalling的抗体，磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有，
: endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
: 因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确，
: 确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低，我就不知道有多低
specific, because the signal is highly focused in a small subcellular region
. Once you break the tissue, the Akt is diluted. In addition, Akt could get
degraded quickly, especially in the case of constitutive active Akt.
【在 l******n 的大作中提到】
: 谢楼上各位。蛋白是血管平滑肌特异性akt.SM22-HA-AKT,加了一个tag的话是90kd,
: endogenous是50多，两个能区分。
: 分离蛋白是匀浆3次，用的是millipore的kit,270块钱能做13毫升的样品。kit里面有
: peotease, phosphatase inhibitor mix。
: 上western, 用cell signalling的抗体，磷酸化和未磷酸化的AKT条带都没有，
: endogenous 磷酸化和未磷酸化的条带都有。
: 因此对他的这个老鼠表示怀疑。不过他给我几个老鼠做genotyping的话还是100%准确，
: 确实有transgene.今天他们说这个promoter表达很低，我就不知道有多低
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