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求助，单酶切连接全部反向怎么办？急求！！！

求助，单酶切连接全部反向怎么办？急求！！！# Biology - 生物学

s*22011-10-05 07:10

1 楼

土博。2004年来美国。一做11片，书稿1片，非一做19片。
最近第10年生物千老，找工作，给老板发信200封，56人拒绝， 4人给面试机会，只有
1个Research Associate 的Offer, 老板的NIH经费2015年5月31日结束，老板说，该
岗位最多14个月，如果经费提前用完，发不出工资了，也许11个月， 12个月走人也有
可能。
找实验室技术员的信件25封，全部被据
找公司，医院技术员35封，全部被据。
结论，只有转行是唯一出路。

z*e2011-10-05 07:10

2 楼

rt
seriously。

f*t2011-10-05 07:10

3 楼

【以下文字转载自 PennySaver 讨论区】
发信人: flowerrabbit (be happy), 信区: PennySaver
标题: chase的150 cash back
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jul 10 17:22:17 2011, 美东)
有谁弄了chase的150 cash back么？好像是每月有10-15月费。有啥方法能免么？
非常感谢! :)

u*d2011-10-05 07:10

4 楼

What is the city/state name for IAD?
I-485上要填city/state:
I-765上没有要求。
从IAD入境，I-94上写的是WAS，请问这两个到底咋填？
google IAD address：
Dulles Airport Address: *
Dulles International Airport
Aviation Dr & Autopilot Dr
Sterling, VA 20166
* Intersection of two streets within the airport.
The Dulles Airport mailing address is:
1 Saarinen Circle, Dulles, VA 20166.
Thanks!

q*n2011-10-05 07:10

5 楼

国际联合宗教会评选：佛教获得全球「最佳宗教世界」奖
据《日内瓦论坛报》报导，国际联合宗教会（ICARUS）票选佛教获得全球「最佳宗
教世界」奖。总部设在瑞士日内瓦的国际联合宗教会（ICARUS），基于提高并促进宗教
和灵性的融合与交流，今年七月投票决议结果，赋予佛教团体最高荣耀奖，一致表决佛
教是「世界上最好的宗教」。
这个奖项是由二百位宗教领袖共同参与国际圆桌会议，投票决定。会中值得一提的
是，很多宗教领袖并没有选择自己的宗教，而是把自己手中神圣一票投给佛教，虽然佛
教徒只占ICARUS会员的极少数，但得票数与呼声却最高。
国际联合宗教会的研究主管伊卡罗斯认为，佛教能赢得世界最好宗教荣耀，是因为
在过去历史中，没有一场战争是以佛教名义而战，与其他宗教明显不同。他认为佛教徒
真正实践所宣导的宗教精神，而这也是佛教比其他宗教做得更彻底的地方。
Belfast天主教神父泰德（Ted O'Shaughnessy）表示，他也投佛教一票，他虽崇爱天
主教，但内心常深感不安，因为在宣导基督爱的同时，往往在圣经里发现为上帝而杀害
异教徒的经文。
穆斯林的神职人员塔尔阿斌‧魏塞德（Tal Bin Wassad）说：「虽然我是虔诚
的穆斯林，但看到很多个人的忿怒和瞋恨，藉用杀戮方式表达他们对宗教的崇敬，而不
是自我调解的途径。」
另犹太教拉比罗宾‧山谬‧华圣斯坦（Rabbi Shmuel Wasserstein）说
：「我爱犹太教，这是世界上最大的宗教，但自一九九三年以来，我每天都在练习内观
禅修，并将作为修持功课之一。」
「佛教徒备受肯定」，身为巴基斯坦的穆斯林社团，也是国际联合宗教会投票权的委
员之一的魏塞德（Wassad）说：「事实上，我最好朋友当中，有不少人是佛教徒。」
国际联合宗教会目前尚未找到愿意受奖团体，当被问及为什么佛教界拒绝接受奖项
时，缅甸翰达比丘（Bhante Ghurata Hanta）表示：「我们感谢佛教被肯定，但此奖是
属于全人类，因每人皆有佛性。」
－－－－－－
注：以上消息是2009年的。呵呵

m*52011-10-05 07:10

6 楼

前的状况是单酶切AGEI,用T4ligase过夜后转化
菌系试过DH5alpha和Top 10。
所有连接都是反向的。
目前的情况是质粒没法做任何改动，只能在insert上做手脚，但问题是不知道症结在哪
里从何改其

e*s2011-10-05 07:10

7 楼

有卡就转行吧。
200封信！这200个都是打过广告的吗？

也有

【在 s*******2 的大作中提到】

: 土博。2004年来美国。一做11片，书稿1片，非一做19片。
: 最近第10年生物千老，找工作，给老板发信200封，56人拒绝， 4人给面试机会，只有
: 1个Research Associate 的Offer, 老板的NIH经费2015年5月31日结束，老板说，该
: 岗位最多14个月，如果经费提前用完，发不出工资了，也许11个月， 12个月走人也有
: 可能。
: 找实验室技术员的信件25封，全部被据
: 找公司，医院技术员35封，全部被据。
: 结论，只有转行是唯一出路。

S*a2011-10-05 07:10

8 楼

......
给包子的话我写给你
多练练25很轻松
类似的，我面试的时候20min写过KMP字符串匹配
这些经典算法我都每次面试前都会过一遍
如果是电面，我就直接翻出写过的code来贴过去

【在 z****e 的大作中提到】

: rt
: seriously。

s*c2011-10-05 07:10

9 楼

DD500

【在 f**********t 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 PennySaver 讨论区】
: 发信人: flowerrabbit (be happy), 信区: PennySaver
: 标题: chase的150 cash back
: 发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jul 10 17:22:17 2011, 美东)
: 有谁弄了chase的150 cash back么？好像是每月有10-15月费。有啥方法能免么？
: 非常感谢! :)

a*x2011-10-05 07:10

10 楼

杜蕾斯啊

【在 u****d 的大作中提到】

: What is the city/state name for IAD?
: I-485上要填city/state:
: I-765上没有要求。
: 从IAD入境，I-94上写的是WAS，请问这两个到底咋填？
: google IAD address：
: Dulles Airport Address: *
: Dulles International Airport
: Aviation Dr & Autopilot Dr
: Sterling, VA 20166
: * Intersection of two streets within the airport.

w*g2011-10-05 07:10

11 楼

这个＂国际联合宗教会＂和你那个＂世界宗教联合大会＂还真不是一个。。：）

s*s2011-10-05 07:10

12 楼

什么叫做所有，你抽了几个？

【在 m******5 的大作中提到】

: 前的状况是单酶切AGEI,用T4ligase过夜后转化
: 菌系试过DH5alpha和Top 10。
: 所有连接都是反向的。
: 目前的情况是质粒没法做任何改动，只能在insert上做手脚，但问题是不知道症结在哪
: 里从何改其

M*k2011-10-05 07:10

13 楼

Research Associate 给多少钱？

x*32011-10-05 07:10

14 楼

顶一下，向牛人学习，呵呵

【在 S******a 的大作中提到】

: ......
: 给包子的话我写给你
: 多练练25很轻松
: 类似的，我面试的时候20min写过KMP字符串匹配
: 这些经典算法我都每次面试前都会过一遍
: 如果是电面，我就直接翻出写过的code来贴过去

f*t2011-10-05 07:10

15 楼

啥意思？

【在 s*****c 的大作中提到】

: DD500

h*t2011-10-05 07:10

16 楼

我在IAD 入关， I94上盖的戳是 WAS，所以我觉得应该填 Washington, DC。

w*r2011-10-05 07:10

17 楼

这个奖更是个大笑话。有个人的佛真的是修
到屁眼里去了。鉴定完毕。

【在 w****g 的大作中提到】

: 这个＂国际联合宗教会＂和你那个＂世界宗教联合大会＂还真不是一个。。：）

m*52011-10-05 07:10

18 楼

18个酶切验证阳性的克隆
这个东西plasmid比较大（13k）不太好连，这18个是从200多个克隆里挑出来的……

【在 s******s 的大作中提到】

: 什么叫做所有，你抽了几个？

s*22011-10-05 07:10

19 楼

太低了。还是专行吧。

【在 M*****k 的大作中提到】

: Research Associate 给多少钱？

x*32011-10-05 07:10

20 楼

再问一下，这个是要你实现strstr吗

【在 S******a 的大作中提到】

s*c2011-10-05 07:10

21 楼

direct deposit 500刀每月，可以用paypal或者ing转帐

【在 f**********t 的大作中提到】

: 啥意思？

u*d2011-10-05 07:10

22 楼

485上要填 city/state,怎么填?
谢谢

【在 h***t 的大作中提到】

: 我在IAD 入关， I94上盖的戳是 WAS，所以我觉得应该填 Washington, DC。

w*r2011-10-05 07:10

23 楼

http://todayinreligion.blogspot.com/2009/07/best-religion-in-wo

【在 q****n 的大作中提到】

: 国际联合宗教会评选：佛教获得全球「最佳宗教世界」奖
: 据《日内瓦论坛报》报导，国际联合宗教会（ICARUS）票选佛教获得全球「最佳宗
: 教世界」奖。总部设在瑞士日内瓦的国际联合宗教会（ICARUS），基于提高并促进宗教
: 和灵性的融合与交流，今年七月投票决议结果，赋予佛教团体最高荣耀奖，一致表决佛
: 教是「世界上最好的宗教」。
: 这个奖项是由二百位宗教领袖共同参与国际圆桌会议，投票决定。会中值得一提的
: 是，很多宗教领袖并没有选择自己的宗教，而是把自己手中神圣一票投给佛教，虽然佛
: 教徒只占ICARUS会员的极少数，但得票数与呼声却最高。
: 国际联合宗教会的研究主管伊卡罗斯认为，佛教能赢得世界最好宗教荣耀，是因为
: 在过去历史中，没有一场战争是以佛教名义而战，与其他宗教明显不同。他认为佛教徒

s*s2011-10-05 07:10

24 楼

设计PCR引物cover酶切点，然后colony PCR直接批一个96孔板的

【在 m******5 的大作中提到】

: 18个酶切验证阳性的克隆
: 这个东西plasmid比较大（13k）不太好连，这18个是从200多个克隆里挑出来的……

s*22011-10-05 07:10

25 楼

大多数没有。
与我本人专业相关。

【在 e****s 的大作中提到】

: 有卡就转行吧。
: 200封信！这200个都是打过广告的吗？
:
: 也有

m*g2011-10-05 07:10

26 楼

heapsort我觉得比quicksort好写
quicksort下标搞来搞去很烦

f*t2011-10-05 07:10

27 楼

嗯，能用银行卡转么？

【在 s*****c 的大作中提到】

: direct deposit 500刀每月，可以用paypal或者ing转帐

b*d2011-10-05 07:10

28 楼

我是JFK,当然填new york city, ny 啦。

w*g2011-10-05 07:10

29 楼

这个奖的确比较搞，至今还没找到人愿意领。。

【在 w*****r 的大作中提到】

: 这个奖更是个大笑话。有个人的佛真的是修
: 到屁眼里去了。鉴定完毕。

m*52011-10-05 07:10

30 楼

Do you think there might be some substantial problem I need to circumvent by
other methods?

【在 s******s 的大作中提到】

: 设计PCR引物cover酶切点，然后colony PCR直接批一个96孔板的

M*k2011-10-05 07:10

31 楼

准备转啥？？

l*s2011-10-05 07:10

32 楼

不能...

【在 f**********t 的大作中提到】

: 嗯，能用银行卡转么？

B*g2011-10-05 07:10

33 楼

co-ask

【在 u****d 的大作中提到】

w*r2011-10-05 07:10

34 楼

这是几年前的一个闹剧了，我记得当时中文网站就有
人指出来过这是个假新闻，这个组织也跟本不存在。

【在 w****g 的大作中提到】

: 这个奖的确比较搞，至今还没找到人愿意领。。

s*s2011-10-05 07:10

35 楼

colony PCR，有了引物一个上午就解决了。解决不了你再考虑是不是有其他问题

by

【在 m******5 的大作中提到】

: Do you think there might be some substantial problem I need to circumvent by
: other methods?

F*02011-10-05 07:10

36 楼

这也太惨了吧？赶快转行吧

B*g2011-10-05 07:10

37 楼

你也来过？

【在 a***x 的大作中提到】

: 杜蕾斯啊

w*g2011-10-05 07:10

38 楼

哈，不知道是不是假的，不过人家好歹还有个简写。。
不过这种事情是很无聊。。。假的东西再好，也是假的。这样去弘扬佛教没什么好处。
。。以讹传讹，我前一段时间还有听到某个法师也说这个。。

【在 w*****r 的大作中提到】

: 这是几年前的一个闹剧了，我记得当时中文网站就有
: 人指出来过这是个假新闻，这个组织也跟本不存在。

d*u2011-10-05 07:10

39 楼

老天。。我刚设计了一个引物，也是打算用Age1 单酶切去做，质粒也差不多13k。。。

【在 m******5 的大作中提到】

s*22011-10-05 07:10

40 楼

Thanks

【在 F*****0 的大作中提到】

: 这也太惨了吧？赶快转行吧

a*x2011-10-05 07:10

41 楼

我还用过呢

【在 B*****g 的大作中提到】

: 你也来过？

w*r2011-10-05 07:10

42 楼

你想领也没地领，根本就没那么个组织。

【在 w****g 的大作中提到】

: 这个奖的确比较搞，至今还没找到人愿意领。。

m*52011-10-05 07:10

43 楼

这个事情概率很小的，别担心，我用这个质粒连了几个东西，只有这个遇到了全部反向
的情况，之前做了几个都是各半，还有一个是全部正向，当时觉得有什么问题但只觉得lucky，结果报应来了……

【在 d******u 的大作中提到】

: 老天。。我刚设计了一个引物，也是打算用Age1 单酶切去做，质粒也差不多13k。。。

m*k2011-10-05 07:10

44 楼

学生物或者物理的，有个专业叫medical physics可以一试

s*e2011-10-05 07:10

45 楼

貌似单酶切链接总是反向连接产物多一些，似乎携带无意义编码的DNA的质粒总是比有
意义的具有生存优势。colony PCR几乎是必须的后续手段，酶切鉴定我一般都不做。

b*r2011-10-05 07:10

46 楼

很有道理，学习了。不过再转念一想，这些东西应该基本不是能在原核表达的啊，难道
仍然能被微量表达？

【在 s*******e 的大作中提到】

: 貌似单酶切链接总是反向连接产物多一些，似乎携带无意义编码的DNA的质粒总是比有
: 意义的具有生存优势。colony PCR几乎是必须的后续手段，酶切鉴定我一般都不做。

s*e2011-10-05 07:10

47 楼

前面挂着细菌/噬菌体启动子的DNA很好理解，但是很多时候CMV或者昆虫启动子所驱动
的DNA片段也有这个现象，我也很费解。

【在 b****r 的大作中提到】

: 很有道理，学习了。不过再转念一想，这些东西应该基本不是能在原核表达的啊，难道
: 仍然能被微量表达？

y*u2011-10-05 07:10

48 楼

楼上几位都遇到过？

b*r2011-10-05 07:10

49 楼

我有次挑了10多个吧，我记得才100bp，全反的，后来改别的方法clone了

【在 y*********u 的大作中提到】

: 楼上几位都遇到过？

y*u2011-10-05 07:10

50 楼

你觉得和去磷酸化与否有关系么？

【在 b****r 的大作中提到】

: 我有次挑了10多个吧，我记得才100bp，全反的，后来改别的方法clone了

b*82011-10-05 07:10

51 楼

我之前做TA的时候也遇到过这样的情况，我要的是反向链接的，不过连续挑了30几个都
是正向的。后来老板告诉我挑克隆的时候注意同时挑一些个头大的菌落和个头小的菌落
。我发现那些个头小的过夜摇菌的时候长的很差，不是那种均匀的浑浊，而是一团白色
的粘糊糊的附着在tip上，其实之前那30个里我也遇到过这样的，当时以为是污染了于
是把菌液丢掉了，没有抽提。最后那次把所有的菌液抽提，经酶切验证发现那些个头小
的摇菌后呈白色团块状的就是我要的。后来猜测估计反相连接的序列可能会在菌体内表
达某些有毒性的蛋白，所以不容易挑到。

b*r2011-10-05 07:10

52 楼

我向来都去磷酸化的

【在 y*********u 的大作中提到】

: 你觉得和去磷酸化与否有关系么？

b*r2011-10-05 07:10

53 楼

有意思，又学了个新东西

【在 b**********8 的大作中提到】

: 我之前做TA的时候也遇到过这样的情况，我要的是反向链接的，不过连续挑了30几个都
: 是正向的。后来老板告诉我挑克隆的时候注意同时挑一些个头大的菌落和个头小的菌落
: 。我发现那些个头小的过夜摇菌的时候长的很差，不是那种均匀的浑浊，而是一团白色
: 的粘糊糊的附着在tip上，其实之前那30个里我也遇到过这样的，当时以为是污染了于
: 是把菌液丢掉了，没有抽提。最后那次把所有的菌液抽提，经酶切验证发现那些个头小
: 的摇菌后呈白色团块状的就是我要的。后来猜测估计反相连接的序列可能会在菌体内表
: 达某些有毒性的蛋白，所以不容易挑到。