请教，454 Sequencing/ Y2H 出来的奇怪问题# Biology - 生物学
a*1
1 楼
准备让我妈妈暑假带我姐姐的两个小孩暑假来美国玩一两个月，我姐姐的小孩一个大学
一个小学 。 爸爸在国内。要在上海签证。
现在预约签证要等多久能预约上？现在签证形式是不是不大好？
一个小学 。 爸爸在国内。要在上海签证。
现在预约签证要等多久能预约上？现在签证形式是不是不大好？
s*o
2 楼
过内搞房产开发的朋友来考察, 我就知道一个Palm beach, 还有其他地方吗?
n*7
3 楼
事情是这样，我们用RT-PCR克隆了一些gene的transcript （CDS only），然后丢给454
测了，然后把其中的一些克隆又拿去做了Y2H。我发现有好几个基因都有个特别的
transcript克隆出来。它们的特点是：
1. 超级短。往往gene有七八个exon，这个transcript就在取了第一个和最后一个exon
的各一部分了事。一共也就200个nt左右
2. READS coverage很低。我们平均的coverage在60X+，这几个小东西也就1-2X，因为
也很短，也就是说，就一两条reads支持。很奇怪，因为我们是用clone测序，所以这个
跟表达量也没关系。后续的Sanger data也确认了这些短序列
3. 不是canonical splicing site。把这些序列align的genome的话，都是覆盖最5'和
最3'端的，之间是一个巨大的gap。如果gap是spliced intron的话，对应的splicing
site不是GU..AG。
4. interaction partner往往很多。比如有个transcript，有15个partner筛出来，筛
了几遍的。而且其他这个gene的其他几个transcript没有任何partner鉴定出来。其中
有个还是跟最短的这个差不多的短序列，不过要长点。
我的问题是：
1. 这些短序列是真实的，还是可能什么PCR/克隆/测序过程造成的artifact？如果真实
的，是Alternative splicing的结果，还是更可能是个huge indel （或者说CNV
deletion）？
2. 为什么它们的read coverage会很低？我们是对克隆测序，按说跟原始表达水平没有
关系。
3. 这些短序列的interaction结果有意义吗？因为read coverage低，我处理的时候把
它们都过滤掉了。而它们的interaction partner虽然应该是真实的（起码在in vitro
水平），但是我觉得是unstructured 序列粘附的结果，跟对应gene的功能关系不大，
放到分析里面只能成为噪音。所以我倾向于丢掉这些序列和它们的PPI结果。 但是我们
组的大姐非常不愿意丢掉这些数据，我们老板也是觉得越多越好，头很大。
谢谢先！
另外，我最近发现我们检测出来的一个有40+个interaction partner的clone reading-
frame是错的，跟我们想要的蛋白完全没关系。就是丢掉这个蛋白，老板都撇了半天嘴
。。。
测了，然后把其中的一些克隆又拿去做了Y2H。我发现有好几个基因都有个特别的
transcript克隆出来。它们的特点是：
1. 超级短。往往gene有七八个exon，这个transcript就在取了第一个和最后一个exon
的各一部分了事。一共也就200个nt左右
2. READS coverage很低。我们平均的coverage在60X+，这几个小东西也就1-2X，因为
也很短，也就是说，就一两条reads支持。很奇怪，因为我们是用clone测序，所以这个
跟表达量也没关系。后续的Sanger data也确认了这些短序列
3. 不是canonical splicing site。把这些序列align的genome的话，都是覆盖最5'和
最3'端的，之间是一个巨大的gap。如果gap是spliced intron的话，对应的splicing
site不是GU..AG。
4. interaction partner往往很多。比如有个transcript，有15个partner筛出来，筛
了几遍的。而且其他这个gene的其他几个transcript没有任何partner鉴定出来。其中
有个还是跟最短的这个差不多的短序列，不过要长点。
我的问题是：
1. 这些短序列是真实的，还是可能什么PCR/克隆/测序过程造成的artifact？如果真实
的，是Alternative splicing的结果，还是更可能是个huge indel （或者说CNV
deletion）？
2. 为什么它们的read coverage会很低？我们是对克隆测序，按说跟原始表达水平没有
关系。
3. 这些短序列的interaction结果有意义吗？因为read coverage低，我处理的时候把
它们都过滤掉了。而它们的interaction partner虽然应该是真实的（起码在in vitro
水平），但是我觉得是unstructured 序列粘附的结果，跟对应gene的功能关系不大，
放到分析里面只能成为噪音。所以我倾向于丢掉这些序列和它们的PPI结果。 但是我们
组的大姐非常不愿意丢掉这些数据，我们老板也是觉得越多越好，头很大。
谢谢先！
另外，我最近发现我们检测出来的一个有40+个interaction partner的clone reading-
frame是错的，跟我们想要的蛋白完全没关系。就是丢掉这个蛋白，老板都撇了半天嘴
。。。
r*i
4 楼
你这个可以到签证官网查到预约时间，签证形势去搜最近面签的经验贴，google一切都
能查到。
能查到。
g*9
5 楼
It has been a while since I visited Miami, but I looked up my sales record,
here are some areas near Miami than have placed very large orders from me.
South Beach
Coconut Grove
Fisher Island
Palm Island
Hibiscus Island
San Marino Island
Dl Lido Island
River Alto Island
Belle Island
Key Biscayne
Mid-Beach
Star Island
Indian Island
Bal Harbour
Aventura
Anyway I think you can just look up Ferrari and Lamborghini dealers in the
area, you will find the rich neighbourhood.
【在 s*******o 的大作中提到】
: 过内搞房产开发的朋友来考察, 我就知道一个Palm beach, 还有其他地方吗?
here are some areas near Miami than have placed very large orders from me.
South Beach
Coconut Grove
Fisher Island
Palm Island
Hibiscus Island
San Marino Island
Dl Lido Island
River Alto Island
Belle Island
Key Biscayne
Mid-Beach
Star Island
Indian Island
Bal Harbour
Aventura
Anyway I think you can just look up Ferrari and Lamborghini dealers in the
area, you will find the rich neighbourhood.
【在 s*******o 的大作中提到】
: 过内搞房产开发的朋友来考察, 我就知道一个Palm beach, 还有其他地方吗?
n*7
6 楼
up一下
想来想去还是觉得是disorder protein sequence导致的非特异结合
至于序列本身的可靠度，看了一圈est，没有支持的
准备看看RNA-seq数据里面有没有对得上的
想来想去还是觉得是disorder protein sequence导致的非特异结合
至于序列本身的可靠度，看了一圈est，没有支持的
准备看看RNA-seq数据里面有没有对得上的
s*o
7 楼
Thanks, Buddy!
i*g
8 楼
你看一下对应的氨基酸序列
一般这些序列偏酸性，artifact of Y2H
transcripts是指mRNA而来
你的5+3 从哪来？ 是Y2H自己生成的？
一般这些序列偏酸性，artifact of Y2H
transcripts是指mRNA而来
你的5+3 从哪来？ 是Y2H自己生成的？
n*7
9 楼
这些序列都是cDNA clone
在对比了测序结果和Y2H结果之后，我觉得很蹊跷
比如附件的那个'F07'，跟对应的REFSEQ序列比，只有最两端的序列，我怎么都觉得不
像是splicing的产物
【在 i*****g 的大作中提到】
: 你看一下对应的氨基酸序列
: 一般这些序列偏酸性，artifact of Y2H
: transcripts是指mRNA而来
: 你的5+3 从哪来？ 是Y2H自己生成的？
在对比了测序结果和Y2H结果之后，我觉得很蹊跷
比如附件的那个'F07'，跟对应的REFSEQ序列比，只有最两端的序列，我怎么都觉得不
像是splicing的产物
【在 i*****g 的大作中提到】
: 你看一下对应的氨基酸序列
: 一般这些序列偏酸性，artifact of Y2H
: transcripts是指mRNA而来
: 你的5+3 从哪来？ 是Y2H自己生成的？
i*g
10 楼
搞不清楚啊
或许是mRNA 2级结构，或降解产物
RT-PCR只选取了这些片段，然后你们是用这个RT-PCR的混合产物，去做Y2H？
这些片段到Y2H里面有prey出来，这个好理解，是artificat of Y2H
I do not think the yeast spontaneously deletes the CDS to form a fragment
CDS.
或许是mRNA 2级结构，或降解产物
RT-PCR只选取了这些片段，然后你们是用这个RT-PCR的混合产物，去做Y2H？
这些片段到Y2H里面有prey出来，这个好理解，是artificat of Y2H
I do not think the yeast spontaneously deletes the CDS to form a fragment
CDS.
i*g
11 楼
今天早上爬起来
大脑忽然自己冒出对这个问题的解答
可能RNA转录一般没有那么高保真，错误的转录就经过连续splicing，形成5+3的短RNA
，然后被RT-PCR 搞了出来
大脑忽然自己冒出对这个问题的解答
可能RNA转录一般没有那么高保真，错误的转录就经过连续splicing，形成5+3的短RNA
，然后被RT-PCR 搞了出来
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