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问个关于overexpress pri-和pre-miRNA质粒构建的问题

问个关于overexpress pri-和pre-miRNA质粒构建的问题# Biology - 生物学

d*l2012-01-24 08:01

1 楼

实验准备构建miRNA表达的质粒构建，有两个问题向大牛们请教
1）用pre-miRNA和pri-miRNA序列构建质粒，我发现文献上两者都有。两者哪个更好？
各有什么优点和缺点。
2）用genomic DNA做模板好，还是用RNA转换成cDNA做模板好？
第一次做，真心求教

B*o2012-01-24 08:01

2 楼

不太明白你的意思。就我知道的表达microRNA的方法，最常用的有两种，一种是pre-
miR再加上其flanking的genomic sequence。一般左右两边取150bp左右就足够了。另一
种是用已知的microRNA backbone，把中间的mature miR sequence给换成你想表达的
miR。这种方法好像就Hannon等人在用，不普遍。我自己的经验是，第一种方法比较好
，特异性好，表达量高。
用Genomic DNA做模板。cDNA没法做吧。primary transcript很快就被Drosha处理掉了
，你的cDNA里啥都找不到

【在 d*******l 的大作中提到】

: 实验准备构建miRNA表达的质粒构建，有两个问题向大牛们请教
: 1）用pre-miRNA和pri-miRNA序列构建质粒，我发现文献上两者都有。两者哪个更好？
: 各有什么优点和缺点。
: 2）用genomic DNA做模板好，还是用RNA转换成cDNA做模板好？
: 第一次做，真心求教

c*g2012-01-24 08:01

3 楼

1）肯定是pri好，miRNA的preprocessing应该是context dependent，比如说有些
intronic的miRNA的mature是coupled with splicing的。当然，你可以minimally
define可以被细胞preprocess的pre-miRNA，那肯定会更简单一些，这个是不是叫shRNA？
2）关键的问题是你的RNA包含了你需要的所有序列吗？如果是，不就是一串DNA吗，什
么做模板没区别。

【在 d*******l 的大作中提到】