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请expression profiling 方面的大牛们指教

请expression profiling 方面的大牛们指教# Biology - 生物学

p*r2012-01-26 08:01

1 楼

Bloomberg
Mortgage-Bond Yields That Guide Loans Soar Most Since December
March 24, 2010, 6:06 PM EDT
By Jody Shenn
March 24 (Bloomberg) -- Yields on Fannie Mae and Freddie Mac mortgage
securities jumped the most in almost four months as rates on benchmark U.S.
government notes soared after a record- tying Treasury auction, signaling
rising borrowing costs for new home loans.
Yields on Fannie Mae’s current-coupon 30-year fixed-rate mortgage-backed
securities climbed 0.17 percentage point to 4.5 p

W*E2012-01-26 08:01

2 楼

无相念佛───大势至菩萨念佛圆通法门之理论与入门
禪净互通
末法时期，常有佛弟子因為修行法门之不同而相互评论高下，尤其是净土与禪的修行
者。
某些修禪的人认為念佛人大多心向外求，求佛、求菩萨，只知唸佛，不知内摄，不知
开发自己本具的佛性。某些念佛人则认為修禪人狂妄自大，不知念佛法门可以三根普被
、利钝兼收。凡此皆因末曾深入禪与净土的各种法门，而生误会。以致教内互动干戈，
或者言语批评，或者写文章，打笔仗，让教外人士看笑话，也使某些即将学佛的人，因
而退心，转入外教去了。这便是断人慧命，罪过极大。弘一大师说得好：「不让古人是
谓有志，不让今人是谓无量」。末学以為：在未深入了解对方所修法门之前，不应随
意以自己的主观来批评教界人士。深入了解并实际修持一段时间，证得一些境界之后，
才可基於善意而於私下向对方提出自己的见解。
近代常有高僧大德倡言「禪净双修」，说禪与净土可以互通。便有某些人因此心生疑
惑。认為念佛须执持圣号，口唸心念；苦修观者则有佛之形像。而禪门以无门為门，扫
除一切相，所谓言语道断、心行处灭。如何能互通？又如何能双修呢？
这样的疑惑，存在某些初入佛门者心中。若能一门深入，将发觉门门相通，最后都无
差别。我们可以这样说：「一切修行法门滙归禪定，一切修行结果滙归净土」。佛法虽
然广有八万四千法门，但每一法门到最后都滙归於定，因定而依四圣諦、八正道、十二
因缘、四念处、第一义諦等发禪，亲见佛性或断除烦恼。
念佛人於此世界，修念佛法门而悟入佛性者是如此，带业往生至极乐世界者，於花开
见佛后，闻法而入无生忍（註二），亦復如此。是故一切修行法门皆当滙归於禪定。
因此，广义的说，八万四千法门，包括净土的各种法门在内，都属於禪定的范围，而
八万四千法门之修持，只要是有修有证者，多少证得唯心净土。若到无学（註三）之阶
位，则安住涅槃，真是净土。若到此地位，随意得生诸佛三种净土，即凡圣同居土、方
便有餘土、实报庄严土。若入佛位，自住常寂光净土，是唯心净土，真正的、究竟的净
土，非如前三种净土是诸佛化现的化土。是故，禪定是方法，净土是结果。明乎此，即
无需為禪与净土而互相争执。
三宝弟子在此世界修学禪定，是难行道，也是速成道。往生极乐世界是易行道，若具
此无相念佛工夫者，欲往生极乐净土，一生即可成办；若以证得究竟解脱境界而言，则
往生极乐净土者所需时间超过在此世界之修行者十百千万倍。此非本书所欲叙述之范
围，不拟详细解说。
註二、无生忍：分证解脱乃至究竟解脱皆是无生忍。
註三、无学：有修有证谓之有学，或称学人。究竟解脱者於解脱道已经亲证并究竟了
知，已无可学谓之无学
===
详阅全文
无相念佛───大势至菩萨念佛圆通法门之理论与入门
http://www.enlighten.org.tw/book/2

L*a2012-01-26 08:01

3 楼

从用户角度，ipad mini可以直接下载和使用ipad的app吗？
从app developer角度，如果已有iPad app, 需要额外工作，改些东西才能做成iPad
mini的app吗？
谢谢！

J*22012-01-26 08:01

4 楼

PC接无线，还可以当个蓝牙耳机接电话用，就是不知舒适不？

M*n2012-01-26 08:01

5 楼

如果从组织上分离细胞，然后FACS之后再作microarray,
细胞的mRNA到底是不是还能保持 in vivo的水平，
会有很大变化吗？
俺觉得应该直接取组织作microarray,但是这样可能有好几种细胞混合在一起。
今天跟老板讨论一下，把俺搞糊涂了。

l*n2012-01-26 08:01

6 楼

that's the side effect.
the major reason is the bond sales yesterday,
plus fed exit plan end of march.

.

【在 p*****r 的大作中提到】

: Bloomberg
: Mortgage-Bond Yields That Guide Loans Soar Most Since December
: March 24, 2010, 6:06 PM EDT
: By Jody Shenn
: March 24 (Bloomberg) -- Yields on Fannie Mae and Freddie Mac mortgage
: securities jumped the most in almost four months as rates on benchmark U.S.
: government notes soared after a record- tying Treasury auction, signaling
: rising borrowing costs for new home loans.
: Yields on Fannie Mae’s current-coupon 30-year fixed-rate mortgage-backed
: securities climbed 0.17 percentage point to 4.5 p

W*E2012-01-26 08:01

7 楼

别误会「阿弥陀佛」！
宇宙中，最美妙的共同语言：阿弥陀佛
人类的语言中最好的一句话就是「阿弥陀佛」
有的人一听到就很想笑，学著电视回答「善哉、善哉！」；
有的人一听到就很烦恼地说:
「我又还没死，你怎麼给我念阿弥陀呢？」，
他以為阿弥陀佛是人死掉以后，师父為人超度而念的，这都是错误的看法。
「阿弥陀佛」是什麼意思呢？
我们先来讲「阿弥陀」这三个字，
这三个字是梵语翻译过来的，意思是「无量」。
什麼叫无量？就是很多很多.多到无可限量，
包含无量光明，无量光明是无限的空间中美妙的一切；
又包括无量的寿命，也就是无限的时间中一切庄严美妙。
还有「佛」这个字，它的意思是觉悟者。
他已经觉悟宇宙、人生一切的道理，
而且他的慈悲、智慧透过修行.
都已经开发达到圆满无障碍的地步。
「阿弥陀佛」代表彼此之间
无限祝福的意思，让我们互相祝福前途光明、
消灾延寿，祝福无限吉祥，这就是阿弥陀佛无量的意义。
所以我们念一句阿弥陀佛就包含著无限意义.无限的祝福。
因為他的意义是无量光明寿命、无量慈悲智慧、
无量觉悟.无限的欢喜。

m*82012-01-26 08:01

8 楼

ipadmini可以直接使用所有app
用后的感觉：ipad上的软件最好字体变大一点或者改变格局，在ipadmini上看起来才舒
服。不然看起来小了，很多眼睛很吃力。

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7

【在 L********a 的大作中提到】

: 从用户角度，ipad mini可以直接下载和使用ipad的app吗？
: 从app developer角度，如果已有iPad app, 需要额外工作，改些东西才能做成iPad
: mini的app吗？
: 谢谢！

l*12012-01-26 08:01

9 楼

now please try
RNA-Seq
//www.ii.uib.no/~inge/inf389-2010/nihms229948.pdf
plus shRNA not RNAi
microarray is one and half decade ago technique
and RNAi is one decade ago technique.
more please go to
2008 SUNY one PhD dissertation
full text pdf link:
//dspace.sunyconnect.suny.edu/bitstream/handle/1951/47599/000000431.sbu.pdf?sequence=3

【在 M*****n 的大作中提到】

: 如果从组织上分离细胞，然后FACS之后再作microarray,
: 细胞的mRNA到底是不是还能保持 in vivo的水平，
: 会有很大变化吗？
: 俺觉得应该直接取组织作microarray,但是这样可能有好几种细胞混合在一起。
: 今天跟老板讨论一下，把俺搞糊涂了。

M*f2012-01-26 08:01

10 楼

谢谢！阿弥陀佛！

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.2.2

【在 W*********E 的大作中提到】

: 无相念佛───大势至菩萨念佛圆通法门之理论与入门
: 禪净互通
: 末法时期，常有佛弟子因為修行法门之不同而相互评论高下，尤其是净土与禪的修行
: 者。
: 某些修禪的人认為念佛人大多心向外求，求佛、求菩萨，只知唸佛，不知内摄，不知
: 开发自己本具的佛性。某些念佛人则认為修禪人狂妄自大，不知念佛法门可以三根普被
: 、利钝兼收。凡此皆因末曾深入禪与净土的各种法门，而生误会。以致教内互动干戈，
: 或者言语批评，或者写文章，打笔仗，让教外人士看笑话，也使某些即将学佛的人，因
: 而退心，转入外教去了。这便是断人慧命，罪过极大。弘一大师说得好：「不让古人是
: 谓有志，不让今人是谓无量」。末学以為：在未深入了解对方所修法门之前，不应随

l*u2012-01-26 08:01

11 楼

not 大牛 or 牛, just some comments:
it is huge different between cells by FACS and in vivo.
(>30% genes differencially expression)
you could try tissue cryosection+LCM+RNA linear amplification+microarray/RNA
seq

【在 M*****n 的大作中提到】

s*s2012-01-26 08:01

12 楼

貌似RNAlater能够先处理再FACS，你出查查manual, 这样应该
就没问题了。
另外， seq吧。array落伍了。

【在 M*****n 的大作中提到】

l*u2012-01-26 08:01

13 楼

跟later 不 later 没关系，
细胞在酶解等刺激的过程中，基因表达已经发生了很大的变化了，
且不说还有 microenvironment 的彻底不同对基因表达的影响。

【在 s******s 的大作中提到】

: 貌似RNAlater能够先处理再FACS，你出查查manual, 这样应该
: 就没问题了。
: 另外， seq吧。array落伍了。

s*s2012-01-26 08:01

14 楼

确实有变化。不过用later, 也就两分钟，影响不大。

【在 l******u 的大作中提到】

: 跟later 不 later 没关系，
: 细胞在酶解等刺激的过程中，基因表达已经发生了很大的变化了，
: 且不说还有 microenvironment 的彻底不同对基因表达的影响。

R*R2012-01-26 08:01

15 楼

我感觉是用流式筛选过后，细胞微环境发生的变化对基因表达的影响更大。你说的那个
仅仅是保证RNA不讲解。
个人意见。

【在 s******s 的大作中提到】

: 确实有变化。不过用later, 也就两分钟，影响不大。

M*n2012-01-26 08:01

16 楼

RNAseq的数据分析是一个问题
俺问了几个做这个的,好像对RNA seq不是很推荐。
特别是俺们这个没有很好的ref seq
assembly可能不容易做。
俺决定还是snap freeze,不做FACS了。

s*a2012-01-26 08:01

17 楼

Don't FACS. Even if the FACS process doesn't change the gene expression of
your cells, it may artificially homogenize your tissue. We tried sorted
cells before and got very weak data. This is not universal, but it's easier
to think about cell composition in a strong signal than to think about gene
regulation out of nothing.

M*n2012-01-26 08:01

18 楼

thanks.
可能老板脑子出毛病了，
以前讲好了不做FACS,
前两天有突然说要做FACS.
俺觉得，他年纪大了，的确应该做点行政工作，少做research了。

easier
gene

【在 s******a 的大作中提到】

: Don't FACS. Even if the FACS process doesn't change the gene expression of
: your cells, it may artificially homogenize your tissue. We tried sorted
: cells before and got very weak data. This is not universal, but it's easier
: to think about cell composition in a strong signal than to think about gene
: regulation out of nothing.

s*s2012-01-26 08:01

19 楼

ft, 都RNAlater了，基因表达还变个头啊。 RNAlater相当于fix了，
再变也就trypsin处理的时候变化2min，后面FACS完全无关

【在 R***R 的大作中提到】

: 我感觉是用流式筛选过后，细胞微环境发生的变化对基因表达的影响更大。你说的那个
: 仅仅是保证RNA不讲解。
: 个人意见。

k*o2012-01-26 08:01

20 楼

Qiagen这试剂看起来真不错。不知道他们开发这个产品的时候，用的是什么方法做
validation？

【在 s******s 的大作中提到】

: ft, 都RNAlater了，基因表达还变个头啊。 RNAlater相当于fix了，
: 再变也就trypsin处理的时候变化2min，后面FACS完全无关

S*l2012-01-26 08:01

21 楼

没有refseq，array就靠谱么？？？

【在 M*****n 的大作中提到】

: RNAseq的数据分析是一个问题
: 俺问了几个做这个的,好像对RNA seq不是很推荐。
: 特别是俺们这个没有很好的ref seq
: assembly可能不容易做。
: 俺决定还是snap freeze,不做FACS了。

s*s2012-01-26 08:01

22 楼

array现在搞SNP，或者搞医学检测还行。实验室里面做expression的分析，
除了对global的profile泛泛而谈，具体到基因上你写在文章里别人也不信
啊。

【在 S**********l 的大作中提到】

: 没有refseq，array就靠谱么？？？

F*p2012-01-26 08:01

23 楼

array + Q-PCR

【在 s******s 的大作中提到】

: array现在搞SNP，或者搞医学检测还行。实验室里面做expression的分析，
: 除了对global的profile泛泛而谈，具体到基因上你写在文章里别人也不信
: 啊。

s*s2012-01-26 08:01

24 楼

对呀。array最后通通要q-pcr验证，多做几组其实不比seq便宜。
再说seq现在可以multiplex, 做expression profile这种，一条Lane
上搞个十个八个都没问题，折合一个sample其实不到200，不算人工

【在 F******p 的大作中提到】

: array + Q-PCR

S*l2012-01-26 08:01

25 楼

seq跟array的correlation还是很高的。
seq这个也有system error,比如长的gene对比俩sample容易significant得多.还有一个
缺陷就是sequence得不够deep的话那些low expression的gene即使有几个fold change
也发现不了。而two channel array一下就看出来了
像楼主这么有钱的还是都做一遍吧。

【在 s******s 的大作中提到】

: 对呀。array最后通通要q-pcr验证，多做几组其实不比seq便宜。
: 再说seq现在可以multiplex, 做expression profile这种，一条Lane
: 上搞个十个八个都没问题，折合一个sample其实不到200，不算人工

M*n2012-01-26 08:01

26 楼

几个大lab还没有发过有关seq 的paper，没有proof of concept, 不敢往里面砸钱。

change

【在 S**********l 的大作中提到】

: seq跟array的correlation还是很高的。
: seq这个也有system error,比如长的gene对比俩sample容易significant得多.还有一个
: 缺陷就是sequence得不够deep的话那些low expression的gene即使有几个fold change
: 也发现不了。而two channel array一下就看出来了
: 像楼主这么有钱的还是都做一遍吧。

t*d2012-01-26 08:01

27 楼

看你要看什么吧。什么实验手段都是有局限性的。如果你比较某种细胞在不同条件下的
表达谱，分离细胞是必须的。而现在分离纯化细胞的方法就那么几种，FACS，MACS，
LCM 等。没有一种perfect。但也只能这样了。选一种做吧。有可能的话，结果用 IHC
或类似方法验证一下呗。
不分离的话，几种细胞混在一起，你怎么解释呢？

【在 M*****n 的大作中提到】

s*s2012-01-26 08:01

28 楼

你说的现在基本上不是问题。人类一个细胞30万transcript，hiseq一条lane
就是20000万reads，还不算马上就要升级。这种比例下，除非基因表达低到
100个细胞只有一个transcript，不会有几fold的change都看不到

change

【在 S**********l 的大作中提到】

S*l2012-01-26 08:01

29 楼

你是说2000万reads？而且你这是什么逻辑啊。。。大多数reads都map到common gene上
了。那些少的还是很少。
俺上个月刚处理了所有的human和mouse的public RNAseq data，这个肯定是个问题。
quality也是问题，很多data都只能map 6,70%. 还有更低的，根本不能map的。也不知
道当初paper怎么发出来的。
我们自己做的seq，有一些只有一个read的gene，后来RTPCR发现是个significant
change candidate，按照一般处理的protocal都要去掉这些gene的（因为read太少）。
这个本来就是seq的缺陷。没办法啊。

【在 s******s 的大作中提到】

: 你说的现在基本上不是问题。人类一个细胞30万transcript，hiseq一条lane
: 就是20000万reads，还不算马上就要升级。这种比例下，除非基因表达低到
: 100个细胞只有一个transcript，不会有几fold的change都看不到
:
: change

n*k2012-01-26 08:01

30 楼

Sounds like array platform has no downside:))), I fully agree with ttd, one
has to make a decision based on their particular circumstance...
BTW, just for the sake of argument:))), how many rare transcript matters(I
did hear even a single transcipt could play a signficant role, but is that
the rule or...and how many rare/novel transcripts are gonna be missed with
array platform...moreover, many significant changes don't have any
biological significance...the base line sometimes could matter much more
than a bigger fold change...So, it is not the math/statics but the biology
that really matters...I am all for Seq approach as of now but admittedly
there are certain scenarios that arrays are still better/easier/faster or
whatever...

【在 S**********l 的大作中提到】

: 你是说2000万reads？而且你这是什么逻辑啊。。。大多数reads都map到common gene上
: 了。那些少的还是很少。
: 俺上个月刚处理了所有的human和mouse的public RNAseq data，这个肯定是个问题。
: quality也是问题，很多data都只能map 6,70%. 还有更低的，根本不能map的。也不知
: 道当初paper怎么发出来的。
: 我们自己做的seq，有一些只有一个read的gene，后来RTPCR发现是个significant
: change candidate，按照一般处理的protocal都要去掉这些gene的（因为read太少）。
: 这个本来就是seq的缺陷。没办法啊。

H*N2012-01-26 08:01

31 楼

RNA-seq is much better than microarrays. It's much more quantitative and
sensitive, since arrays are limited by their dynamic range. You can detect
low fold-changes more reliably. You can get more information such as
alternative splicing. Low-level genes are a problem since not much is known
about their biological significance, but with microarrays these genes cannot
be reliably detected.

s*s2012-01-26 08:01

32 楼

GAII是3000万，去年开始Hiseq2000就是200M，也就是20000万，比你说
的多一个数量级啊。2500更高啊。
我的逻辑你没听懂？最简单的概率统计啊！就是你说map到common gene
的具体数量化啊。假设transcript长度差不多，所谓的低copy，就算1个
transcript per cell, 那就是1 out of 30万，你连续draw两万万次，
就算算上30%不能map，不被draw到的概率是多少？几乎不可能！你说的
以前大概是个问题，现在一年间有reads有数量级的变化了啊！

【在 S**********l 的大作中提到】

c*y2012-01-26 08:01

33 楼

人Sara说的common gene应该是指高表达量的基因，她在这个主题下提到的很多
问题都是存在的，你自己到底看过多少个不同深度的datasets,就来说人家不懂你的逻
辑阿。再加上一般大家都做1个replicate，做differential expression 分析问题多多。

【在 s******s 的大作中提到】

: GAII是3000万，去年开始Hiseq2000就是200M，也就是20000万，比你说
: 的多一个数量级啊。2500更高啊。
: 我的逻辑你没听懂？最简单的概率统计啊！就是你说map到common gene
: 的具体数量化啊。假设transcript长度差不多，所谓的低copy，就算1个
: transcript per cell, 那就是1 out of 30万，你连续draw两万万次，
: 就算算上30%不能map，不被draw到的概率是多少？几乎不可能！你说的
: 以前大概是个问题，现在一年间有reads有数量级的变化了啊！

s*s2012-01-26 08:01

34 楼

Sara泛泛而谈说大多数reads map到common gene, 也就是高表达基因，
所以低表达有很可能map不到。我说了现在的depth有数量级的提升，然后
具体量化了在现在最新depth底下低表达基因就算只有一个copy也不是问
题. 很多问题是以前的技术不够造成的，这些越来越不是问题

多。

【在 c**y 的大作中提到】

: 人Sara说的common gene应该是指高表达量的基因，她在这个主题下提到的很多
: 问题都是存在的，你自己到底看过多少个不同深度的datasets,就来说人家不懂你的逻
: 辑阿。再加上一般大家都做1个replicate，做differential expression 分析问题多多。

n*k2012-01-26 08:01

35 楼

Well, it is all on paper. You know sometimes math/statistics doesn't work
well in biology/practice...BTW, as far as I know...both Cnny and sara are
working on related research areas...

【在 s******s 的大作中提到】

: Sara泛泛而谈说大多数reads map到common gene, 也就是高表达基因，
: 所以低表达有很可能map不到。我说了现在的depth有数量级的提升，然后
: 具体量化了在现在最新depth底下低表达基因就算只有一个copy也不是问
: 题. 很多问题是以前的技术不够造成的，这些越来越不是问题
:
: 多。

n*k2012-01-26 08:01

36 楼

long time no seeing you...so, what's your opinion about Seq V array?
Apparently I only have limited working experience plus lots of reading...So
far, I see Seq is the way to go in general...I am currently doing pair-end
reads for about 30-50M, is it good enough...My last batch data (no replicate
) only produce about 20 genes (significantly different--P<0.001)...the data
largely make sense but no significance...I seriously doubt about the P-value
bearing any meaning/significance here(some told me so too), any thoughts
about that? thanks

多。

【在 c**y 的大作中提到】

M*n2012-01-26 08:01

37 楼

可以in situ, qPCR一个一个confirm
而且可以cross-species comparison

IHC

【在 t*d 的大作中提到】

: 看你要看什么吧。什么实验手段都是有局限性的。如果你比较某种细胞在不同条件下的
: 表达谱，分离细胞是必须的。而现在分离纯化细胞的方法就那么几种，FACS，MACS，
: LCM 等。没有一种perfect。但也只能这样了。选一种做吧。有可能的话，结果用 IHC
: 或类似方法验证一下呗。
: 不分离的话，几种细胞混在一起，你怎么解释呢？

M*n2012-01-26 08:01

38 楼

i am glad that my questions have stimulated this heated discussion
a technical question, what is the amout of RNA needed for either seq or
array analysis?
I am having trouble to get a big amount of RNA.
thanks, big bulls.

t*y2012-01-26 08:01

39 楼

10ng according to our protocol

【在 M*****n 的大作中提到】

: i am glad that my questions have stimulated this heated discussion
: a technical question, what is the amout of RNA needed for either seq or
: array analysis?
: I am having trouble to get a big amount of RNA.
: thanks, big bulls.

c*g2012-01-26 08:01

40 楼

cautiously doubt RT-PCR results for such a lowly expressed gene.
low-abundance transcripts is a problem to all platforms.

【在 S**********l 的大作中提到】

n*k2012-01-26 08:01

41 楼

total RNA or rRNA-depleted/polyA enriched RNAs, protocol pls...

【在 t**********y 的大作中提到】

: 10ng according to our protocol

n*k2012-01-26 08:01

42 楼

Agreed...RT-qPCR is not that straightforward, there are numerous studies
suggesting RT-qPCR confirmation of either RNA-seq or array results could be
very poor/problematic...for low abundant TS, that would be even harder...

【在 c*****g 的大作中提到】

: cautiously doubt RT-PCR results for such a lowly expressed gene.
: low-abundance transcripts is a problem to all platforms.

c*y2012-01-26 08:01

43 楼

No simple answer to Seq V array. It depends on many factors including your
biological questions, your budget and your experimental design for seq/array
etc.. The community awaits a systematic evaluation of cost-benefit trade-
off between seq and array platform for differential gene expression analysis
. Ideally, such evaluation would include an ultra-deep-sequenced RNA-seq
dataset(way deeper than the currently adopted depth) and microarray dataset
on the same set of biological replicates and a gold standard set of
differentially-expressed genes. Difference in algorithms should be also a
focus of evaluation. Back to your RNA-seq data, if you only want to identify
differentially-expressed genes tha t are well-annotated. you would rather
put money on doing single-end sequencing (~50bp) to as deep as your budget
allows. You need biological replicates if you are serious about statistical
analysis. With only one replicate, don't bother those P-values and simply
choose some fold-change cutoff and ensured those genes also have reasonable
expression level based on RNA-seq data under the conditions of interest.
Normalization is also an important part and I would suggest you find some
local bioinformatics collaborator to make it right.

So
replicate
data
value

【在 n********k 的大作中提到】

: long time no seeing you...so, what's your opinion about Seq V array?
: Apparently I only have limited working experience plus lots of reading...So
: far, I see Seq is the way to go in general...I am currently doing pair-end
: reads for about 30-50M, is it good enough...My last batch data (no replicate
: ) only produce about 20 genes (significantly different--P<0.001)...the data
: largely make sense but no significance...I seriously doubt about the P-value
: bearing any meaning/significance here(some told me so too), any thoughts
: about that? thanks
:
: 多。

n*k2012-01-26 08:01

44 楼

I am a bit greedy but so far under very tight budget...it is nice to know
beyond the well annotated ones...I will have three time points and I am now
thinking to use duplicates, do you think that would be enough for any
meaningful statistics?

array
analysis
dataset
identify

【在 c**y 的大作中提到】

: No simple answer to Seq V array. It depends on many factors including your
: biological questions, your budget and your experimental design for seq/array
: etc.. The community awaits a systematic evaluation of cost-benefit trade-
: off between seq and array platform for differential gene expression analysis
: . Ideally, such evaluation would include an ultra-deep-sequenced RNA-seq
: dataset(way deeper than the currently adopted depth) and microarray dataset
: on the same set of biological replicates and a gold standard set of
: differentially-expressed genes. Difference in algorithms should be also a
: focus of evaluation. Back to your RNA-seq data, if you only want to identify
: differentially-expressed genes tha t are well-annotated. you would rather

c*y2012-01-26 08:01

45 楼

To go beyond the well annotated ones, paired-end data is more useful, but
you do need a collaborator like Sara especially you also look at multiple
time point data. Duplicate would be fine.

now

【在 n********k 的大作中提到】

: I am a bit greedy but so far under very tight budget...it is nice to know
: beyond the well annotated ones...I will have three time points and I am now
: thinking to use duplicates, do you think that would be enough for any
: meaningful statistics?
:
: array
: analysis
: dataset
: identify

c*g2012-01-26 08:01

46 楼

"Back to your RNA-seq data, if you only want to identify
differentially-expressed genes tha t are well-annotated. you would rather
put money on doing single-end sequencing (~50bp) to as deep as your budget
allows. "
这不是真的。。。
2 x single-end sequencing 比 1 x paired-end sequencing 在同样的throughput下
贵不少。所以在他的预算允许的情况下，应该做paired-end，甚至应该做multiplex来
消除lane effect etc.
真要做well-annotated genes，还搞啥sequencing，直接就array算了，不知道省多少
事。

array
analysis
dataset
identify

【在 c**y 的大作中提到】

c*g2012-01-26 08:01

47 楼

一个好好design的microarray的实验，重复多，power大，分析方法成熟，
远比一个没有被好好重复的rna-seq要informative得多。
别看rna-seq没几个rep，找那么多基因出来，p value还多暴小，那是因为error根本没
有被很好地model到。
至于unannotated genes，除非你做一个根本没人做的生物，现在像样点的genome，真
有unannotated genes，绝大部分都是低表达的，你需要很深地测序才能准确的
quantitate（注意，quantitation和identification是两码事），或者根本没法被
quantitate。

now

【在 n********k 的大作中提到】

c*g2012-01-26 08:01

48 楼

对于rna而言，本身长度就有限，实际上sequence read的长度比pair不pair要重要的多。

【在 c**y 的大作中提到】

: To go beyond the well annotated ones, paired-end data is more useful, but
: you do need a collaborator like Sara especially you also look at multiple
: time point data. Duplicate would be fine.
:
: now

c*g2012-01-26 08:01

49 楼

当然了，这是对splicing而言，如果你对于gene fusion之类的结构上的变化更感兴趣
，paired-end就很重要了。

多。

【在 c*****g 的大作中提到】

: 对于rna而言，本身长度就有限，实际上sequence read的长度比pair不pair要重要的多。

n*k2012-01-26 08:01

50 楼

thanks a lot...
I already have two sets for array platforms with 10 time points and the data
should be in within a week or so, it was meant for grant data for its quick
turn around....For Seq, I am planning on 100-bp pair end reads with 3 time
points and duplicates: 4 samples/ per lane (50 M reads /per sample). I am
very much interested in both isoforms and non-coding stuff...for some, some
sort of quantification would be good, for others, I don't care much about
quantification...Once there are hints, I am thinking to go for 200M, 1
sample/per lane but would only do for very few selective samples...sounds
reasonable or not...

【在 c*****g 的大作中提到】

: 一个好好design的microarray的实验，重复多，power大，分析方法成熟，
: 远比一个没有被好好重复的rna-seq要informative得多。
: 别看rna-seq没几个rep，找那么多基因出来，p value还多暴小，那是因为error根本没
: 有被很好地model到。
: 至于unannotated genes，除非你做一个根本没人做的生物，现在像样点的genome，真
: 有unannotated genes，绝大部分都是低表达的，你需要很深地测序才能准确的
: quantitate（注意，quantitation和identification是两码事），或者根本没法被
: quantitate。
:
: now

c*y2012-01-26 08:01

51 楼

他肯定有兴趣non-coding rna，对于他有兴趣的rat的cell-type很有可能没有好的
annotation,所以要用paired-end做transcripitome assembly现在很多grant review都会问你干嘛不做rna－seq，这其实很多时候有non-scientific的因素在里面，对于他具体的生物项目，用哪个平台更好还是要他自己
综合来衡量。最理想的，还是要跟local的informatics的人一起讨论实验设计。

【在 c*****g 的大作中提到】

c*y2012-01-26 08:01

52 楼

我们这儿paired-end收费同样throughput要贵，你要是有什么便宜的service推荐，就
好了。

【在 c*****g 的大作中提到】

: "Back to your RNA-seq data, if you only want to identify
: differentially-expressed genes tha t are well-annotated. you would rather
: put money on doing single-end sequencing (~50bp) to as deep as your budget
: allows. "
: 这不是真的。。。
: 2 x single-end sequencing 比 1 x paired-end sequencing 在同样的throughput下
: 贵不少。所以在他的预算允许的情况下，应该做paired-end，甚至应该做multiplex来
: 消除lane effect etc.
: 真要做well-annotated genes，还搞啥sequencing，直接就array算了，不知道省多少
: 事。

c*g2012-01-26 08:01

53 楼

http://www.biotech.wisc.edu/facilities/dnaseq/sequencing/Illumi
这里就是paired-end比single-end便宜（注意，要把single-end的钱乘以2，因为出来
的sequence fragment的个数是一样的，fragment的个数决定于cluster generation，而不是
single或者paired-end），碰巧external user还不贵多少。。。
不太可能同样的数据量paired-end贵的，paired-end的数据质量（尤其是第二个）往往
要差很多。

【在 c**y 的大作中提到】

: 我们这儿paired-end收费同样throughput要贵，你要是有什么便宜的service推荐，就
: 好了。

c*g2012-01-26 08:01

54 楼

绝大部分non-coding RNA都是低表达的，这也是为什么大家一开始认为它们并不重要。
如果你仅仅是想知道non-coding RNA的sequence，不关心sample之间的数量上的比较，
你应该把RNA 'normalize'一下，让低表达的proportion变高，这样更容易被sequence
到。

data
quick
time
some

【在 n********k 的大作中提到】

: thanks a lot...
: I already have two sets for array platforms with 10 time points and the data
: should be in within a week or so, it was meant for grant data for its quick
: turn around....For Seq, I am planning on 100-bp pair end reads with 3 time
: points and duplicates: 4 samples/ per lane (50 M reads /per sample). I am
: very much interested in both isoforms and non-coding stuff...for some, some
: sort of quantification would be good, for others, I don't care much about
: quantification...Once there are hints, I am thinking to go for 200M, 1
: sample/per lane but would only do for very few selective samples...sounds
: reasonable or not...

c*y2012-01-26 08:01

55 楼

谢谢。终端用户关心的是可用的数椐量的cost，而不是raw数据量的cost，在我的有限
的几次经验中（合作者的数据），对于可用数据而言，还是single-endx2稍微cost-
effective一点，这个也可能和实验的人的制备两种library的质量不同有关系。

，而不是

【在 c*****g 的大作中提到】

: http://www.biotech.wisc.edu/facilities/dnaseq/sequencing/Illumi
: 这里就是paired-end比single-end便宜（注意，要把single-end的钱乘以2，因为出来
: 的sequence fragment的个数是一样的，fragment的个数决定于cluster generation，而不是
: single或者paired-end），碰巧external user还不贵多少。。。
: 不太可能同样的数据量paired-end贵的，paired-end的数据质量（尤其是第二个）往往
: 要差很多。

t*y2012-01-26 08:01

56 楼

Total RNA.
I don't have protocol. My boss told me that...

【在 n********k 的大作中提到】

: total RNA or rRNA-depleted/polyA enriched RNAs, protocol pls...

y*i2012-01-26 08:01

57 楼

这么直白的问题居然被讨论的这么复杂
分离完细胞直接在buffer里面加actinomycin不就轻松解决你的问题了么
只要你后面FACS的时间不要太长对于microarray分析足够了

【在 M*****n 的大作中提到】

l*12012-01-26 08:01

58 楼

//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21143212
or
//www.BioTechniques.com/article/113556

【在 n********k 的大作中提到】

: total RNA or rRNA-depleted/polyA enriched RNAs, protocol pls...

l*u2012-01-26 08:01

59 楼

the thing is when you 分离完细胞, the gene expression has already been
changed enormously, then you put actinomycin to inhibit transcription, and ?

【在 y****i 的大作中提到】

: 这么直白的问题居然被讨论的这么复杂
: 分离完细胞直接在buffer里面加actinomycin不就轻松解决你的问题了么
: 只要你后面FACS的时间不要太长对于microarray分析足够了

y*i2012-01-26 08:01

60 楼

lz说他担心从分离以后到FACS之后的影响
要是担心分离过程的影响，从分离细胞的第一步开始就加actinomycin就是了。
这是很常用的protocol，你要是还不放心，还可以杀老鼠前infuse/inject
actinomycin

?

【在 l******u 的大作中提到】

: the thing is when you 分离完细胞, the gene expression has already been
: changed enormously, then you put actinomycin to inhibit transcription, and ?
: