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请教用REAL－TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是－／－ 还是－／+ 的问题？
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请教用REAL－TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是－／－ 还是－／+ 的问题？# Biology - 生物学
t*i
1 楼
@@清场通告@@
**************************************************************************
在版务小组特意允许一天的无限制讨论下，换届的讨论在无数马甲和潜水员的参与下造
成了版面混乱,正常秩序瘫痪. 其中蓄意捣乱和起哄的大家也就心照不宣了．
特此通告清场!! 所有关于版务的帖子将按水分质量, 互相攻击程度来决定是合集还是
删帖. 此通告发出后的相关讨论帖一律删除, 通知无效,继续首发相关帖者封3天. 想继
续讨论换斑竹的请转移到板主之家版. 本帖会在晚上合集，封锁．
***************************************************************************
1)　关于换届我说几句:
其实在马褂老大赴上海以前，我们就已经达成共识，因为客观原因，洛杉矶版主换届是
势在必行的。近几个月来，我们一直在寻觅合适热心的ID出来担当大局．但这并不表明
我们会撒手不管，盲目支持那些唯恐天下不乱，把LA版真正当成公共厕所的人和团体．
###会得到现届小组支持的下届小组组
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J*n
2 楼
我问了周围的几个哥们，都说在找，就是没找到。
太悲剧了。。。。。
大家本着学术的精神讨论一下，怎么搜索阿？
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r*5
3 楼
哪位大狭做过啊，能不能指教下啊， 引物的设计有什么特别要求么？
主要是不会算到底是单拷贝还是双拷贝，
谢谢指教啊！！
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b*7
4 楼

你可以去留圆网的兴趣贴图和成人影视(版块)找找, 找到别忘了法我几个包子

【在 J*****n 的大作中提到】
: 我问了周围的几个哥们，都说在找，就是没找到。
: 太悲剧了。。。。。
: 大家本着学术的精神讨论一下，怎么搜索阿？
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w*n
5 楼
误差很大，为什么不检基因组，跨删除区pcr,根据条带大小，很容易区分-/-,-/+

【在 r*****5 的大作中提到】
: 哪位大狭做过啊，能不能指教下啊， 引物的设计有什么特别要求么？
: 主要是不会算到底是单拷贝还是双拷贝，
: 谢谢指教啊！！
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r*5
6 楼
谢谢指导， 我就是准备跨基因组， 问题是不确定要３PRIMER 一起用，还是两个两个
用啊？
谢谢 ：）
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r*5
7 楼
你的意思是说，跨基因组的话，就可以提取基因组DNA， 然后用普通PCR就可以，对么？
这样可以确定 有没有KNOCKOUT， 但是不能确定是不是+／＿， 我的理解对么？
avatar
D*a
8 楼
为啥要RT PCR？
啥叫跨基因组？
你的mouse breeding 是咋设定的？是tissue specific KO？ 还是传统KO或者hetero
交配 wt？
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w*n
9 楼
电泳后，+/+是一条较大的带，+/-是一大一小，-/-是一条较小的带。

么？

【在 r*****5 的大作中提到】
: 你的意思是说，跨基因组的话，就可以提取基因组DNA， 然后用普通PCR就可以，对么？
: 这样可以确定 有没有KNOCKOUT， 但是不能确定是不是+／＿， 我的理解对么？
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D*a
10 楼
或者也可以设计三个引物，triplex PCR
这样的好处是带的大小可以比较一致，不会出现类似WT大带1000，KO小带200bp 的情况。

【在 w******n 的大作中提到】
: 电泳后，+/+是一条较大的带，+/-是一大一小，-/-是一条较小的带。
:
: 么？
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r*5
11 楼
非常感谢啊， 那就是说要３个PRIMER 一起加， 而不是像普通PCR 那样只用２个
PRIMER，用来做PCR， 对么？

【在 w******n 的大作中提到】
: 电泳后，+/+是一条较大的带，+/-是一大一小，-/-是一条较小的带。
:
: 么？
avatar
r*5
12 楼
我和人家要的老鼠， 传统的KNOCKOUT ，不是组织特意的

【在 D*a 的大作中提到】
: 为啥要RT PCR？
: 啥叫跨基因组？
: 你的mouse breeding 是咋设定的？是tissue specific KO？ 还是传统KO或者hetero
: 交配 wt？
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r*5
13 楼
能具体说说什么 是triplex PCR， 我都没有听说过，哈，谢拉

况。

【在 D*a 的大作中提到】
: 或者也可以设计三个引物，triplex PCR
: 这样的好处是带的大小可以比较一致，不会出现类似WT大带1000，KO小带200bp 的情况。
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l*1
14 楼
Exactly,
Please go to
//www.biotechniques.com/multimedia/archive/00010/01315rr05_10077a.pdf
it shown that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers
and that this triplex PCR can be performed simulta- neously with a universal PCR assay for the detection of
Cre transgenes.
[回复]
[ 8 ]
发信人: robin95 (robin95), 信区: Biology
标 题: Re: 请教用REAL－TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是－／－ 还
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Feb 16 11:31:37 2012, 美东)
>非常感谢啊， 那就是说要３个PRIMER 一起加， 而不是像普通PCR 那样只用２个
>PRIMER，用来做PCR， 对么？

【在 w******n 的大作中提到】
: 电泳后，+/+是一条较大的带，+/-是一大一小，-/-是一条较小的带。
:
: 么？
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D*a
15 楼
你既然不是组织特异的Ko。pcr就很好做了，因为就是KO allele 和WT allele 分别。
genomic PCR 就可以了。回家了不方便发帖， 明天去了实验室给你找个图。
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l*1
16 楼
that 图 where?

【在 D*a 的大作中提到】
: 你既然不是组织特异的Ko。pcr就很好做了，因为就是KO allele 和WT allele 分别。
: genomic PCR 就可以了。回家了不方便发帖， 明天去了实验室给你找个图。
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D*a
17 楼
中间那个蓝的你也可以跟红的配对，把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须
要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。
我们还再加几对其他的引物测其他的transgene，比如cre啥的，也都放到一个program
里面，一次PCR就都有了。
flox啥的你要是不知道自己查查吧。

【在 r*****5 的大作中提到】
: 能具体说说什么 是triplex PCR， 我都没有听说过，哈，谢拉
:
: 况。
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l*1
18 楼
>: flox啥的你要是不知道自己查查吧。
Just go to
//en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_recombination
//en.wikipedia.org/wiki/Floxed
ps:
又学了一招 Merci Dua.

program

【在 D*a 的大作中提到】
: 中间那个蓝的你也可以跟红的配对，把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须
: 要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。
: 我们还再加几对其他的引物测其他的transgene，比如cre啥的，也都放到一个program
: 里面，一次PCR就都有了。
: flox啥的你要是不知道自己查查吧。
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r*5
19 楼
真的非常感谢啊, Dua ：）
讲的很清楚啊，很实用， 给我们老鼠的人的PAPER 里有３个PRIMER， 他们也说了，WT
和KO 应该是多大片段， 我一直不确定怎么两个两个来选PRIMER， 现在知道了是３
个一起用，谢啦，
还有一个问题， 给我们老鼠的人都设计了３个引物了，不知道他们为什么还有
SOUTHERN 来做， 在文章里他们只显示了SOUTHERN 结果，而没有显示PCR 结果，
SOUTHERN 有什么特别的好处么 ？

program

【在 D*a 的大作中提到】
: 中间那个蓝的你也可以跟红的配对，把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须
: 要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。
: 我们还再加几对其他的引物测其他的transgene，比如cre啥的，也都放到一个program
: 里面，一次PCR就都有了。
: flox啥的你要是不知道自己查查吧。
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r*5
20 楼
这文章也很好啊， 我原来一点不懂，没有做过， 谢谢指导，继续学习 ：）

three appropriately placed primers
universal PCR assay for the detection of

【在 l**********1 的大作中提到】
: Exactly,
: Please go to
: //www.biotechniques.com/multimedia/archive/00010/01315rr05_10077a.pdf
: it shown that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers
: and that this triplex PCR can be performed simulta- neously with a universal PCR assay for the detection of
: Cre transgenes.
: [回复]
: [ 8 ]
: 发信人: robin95 (robin95), 信区: Biology
: 标 题: Re: 请教用REAL－TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是－／－ 还
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D*a
21 楼
southern是把关，PCR有假阳性，再具体的我也不知道了，只知道做老鼠的时候选老鼠
必须要southern。
但是老鼠做完了以后再正常breeding就没必要southern拉。

WT

【在 r*****5 的大作中提到】
: 真的非常感谢啊, Dua ：）
: 讲的很清楚啊，很实用， 给我们老鼠的人的PAPER 里有３个PRIMER， 他们也说了，WT
: 和KO 应该是多大片段， 我一直不确定怎么两个两个来选PRIMER， 现在知道了是３
: 个一起用，谢啦，
: 还有一个问题， 给我们老鼠的人都设计了３个引物了，不知道他们为什么还有
: SOUTHERN 来做， 在文章里他们只显示了SOUTHERN 结果，而没有显示PCR 结果，
: SOUTHERN 有什么特别的好处么 ？
:
: program
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r*5
22 楼
哦，是这样啊， 那老鼠是人家做好的，我们管人家要的，所以就做PCR 来试试，到时
候给你信息反馈啊，哈，真的很感谢 ：）
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