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TEV切蛋白

TEV切蛋白# Biology - 生物学

m*12015-06-19 07:06

1 楼

ride aid 应该属于药店吧
买1500 的 visa gift card ，是那种需要4.95 激活费的吧？我看到上面又写
vanilla , 和你们用于 bb 的卡不是一回事吧？我没蓝鸟卡，就是把visa gc 拿去可
以接受visa 的地方就可以把，这个gc 只能当credit card 用吗但是卡上面又写了
debit,又没有设 pin ,所以只能当信用卡是吗

w*82015-06-19 07:06

2 楼

我最近用TEV protease cleave我的蛋白中的TEV site，好几次都害得蛋白全部沉淀出
来。有没有人有相同的经验啊？难道是TEV加的太多了吗？我是1：20的加TEV

l*k2015-06-19 07:06

3 楼

这中文确实读不懂

【在 m*****1 的大作中提到】

: ride aid 应该属于药店吧
: 买1500 的 visa gift card ，是那种需要4.95 激活费的吧？我看到上面又写
: vanilla , 和你们用于 bb 的卡不是一回事吧？我没蓝鸟卡，就是把visa gc 拿去可
: 以接受visa 的地方就可以把，这个gc 只能当credit card 用吗但是卡上面又写了
: debit,又没有设 pin ,所以只能当信用卡是吗

j*n2015-06-19 07:06

4 楼

切fusion tag？是不是目标蛋白本身不太溶？

m*12015-06-19 07:06

5 楼

语文不及格，不好意思。就是想问应该吗哪种visa gc 最方便最划算然后吗的卡是可以
当信用卡用还是debit 用

w*82015-06-19 07:06

6 楼

嗯我要切掉fusion tag，MBP。目标蛋白应该还可以，是个有结构的蛋白。而且我做过
几次，只有一两次没有沉出来，其它几次都沉出来了。都不知道哪出了问题。

【在 j****n 的大作中提到】

: 切fusion tag？是不是目标蛋白本身不太溶？

y*i2015-06-19 07:06

7 楼

Congratulations!
You got everything right //hoho

【在 m*****1 的大作中提到】

b*y2015-06-19 07:06

8 楼

Try to use more and fresh DTT. Use more buffering reagents to counter the
acidity of DTT if it isn't pHed. Good luck!

m*12015-06-19 07:06

9 楼

谢谢，我明白了，就是想确认下。因为从来没买过 visa gc 怕搞错了。

t*o2015-06-19 07:06

10 楼

有种可能是，你的fusion protein在低盐的情况下溶解度很好，但蛋白本身需要高盐，
所以TEV切了后蛋白沉淀。如果是这样的话，可以在加TEV后若干时间，比如4C, 三小时
，在蛋白还没沉淀前，dialysis到高盐里。我以前一个蛋白就是这么纯化出来的。

【在 w*****8 的大作中提到】

: 我最近用TEV protease cleave我的蛋白中的TEV site，好几次都害得蛋白全部沉淀出
: 来。有没有人有相同的经验啊？难道是TEV加的太多了吗？我是1：20的加TEV

w*82015-06-19 07:06

11 楼

谢谢你的建议。可是我切完后的蛋白是要长晶体的。不能dialysis到高盐里呀。所以我
的盐浓度只用了150mM。不过我切的时候蛋白浓度只有0.5mg/ml，就是怕溶解度不好沉
出来。我都trouble shooting很久了

【在 t*******o 的大作中提到】

: 有种可能是，你的fusion protein在低盐的情况下溶解度很好，但蛋白本身需要高盐，
: 所以TEV切了后蛋白沉淀。如果是这样的话，可以在加TEV后若干时间，比如4C, 三小时
: ，在蛋白还没沉淀前，dialysis到高盐里。我以前一个蛋白就是这么纯化出来的。

w*82015-06-19 07:06

12 楼

我的TEV里的reducing reagent是TCEP，而且也只有0.5mM，这个浓度够不够？

【在 b******y 的大作中提到】

: Try to use more and fresh DTT. Use more buffering reagents to counter the
: acidity of DTT if it isn't pHed. Good luck!

t*o2015-06-19 07:06

13 楼

我也是做结晶的。你这种情况多半是溶液不对。所谓高盐是相对TEV酶切的。比如
500mM盐。你得先保证你的蛋白稳定了才能谈其他的对不对。楼上说的加DTT估计也有
帮助。0.5mM TCEP还是弱了点。
再说了，谁说高一点的盐不能结晶的？最普通的做法就是，screening时，set up好
droplet后，密封前，在所有的well solution里补加等浓度的盐，比如500mM.

【在 w*****8 的大作中提到】

: 谢谢你的建议。可是我切完后的蛋白是要长晶体的。不能dialysis到高盐里呀。所以我
: 的盐浓度只用了150mM。不过我切的时候蛋白浓度只有0.5mg/ml，就是怕溶解度不好沉
: 出来。我都trouble shooting很久了

e*s2015-06-19 07:06

14 楼

有一个概念叫soluable inclusion body. 就是说，因为tag如GST, MBP本身有很好的溶
解性，有时候能提高融合蛋白的可溶性，但有时候，目标蛋白虽未完全折叠，因为tag
的存在也可溶，这就是soluable inclusion body. 若去处tag,蛋白就容易析出。
LZ遇见的可能是这一情况。为除tag的融合蛋白的活性检测过吗？

w*82015-06-19 07:06

15 楼

这个建议很好呀。我试试DTT和高一点的盐吧。

【在 t*******o 的大作中提到】

: 我也是做结晶的。你这种情况多半是溶液不对。所谓高盐是相对TEV酶切的。比如
: 500mM盐。你得先保证你的蛋白稳定了才能谈其他的对不对。楼上说的加DTT估计也有
: 帮助。0.5mM TCEP还是弱了点。
: 再说了，谁说高一点的盐不能结晶的？最普通的做法就是，screening时，set up好
: droplet后，密封前，在所有的well solution里补加等浓度的盐，比如500mM.

w*82015-06-19 07:06

16 楼

我测过切完的蛋白的DSF，是fold的，还可以和inhibitor bind

tag

【在 e****s 的大作中提到】

: 有一个概念叫soluable inclusion body. 就是说，因为tag如GST, MBP本身有很好的溶
: 解性，有时候能提高融合蛋白的可溶性，但有时候，目标蛋白虽未完全折叠，因为tag
: 的存在也可溶，这就是soluable inclusion body. 若去处tag,蛋白就容易析出。
: LZ遇见的可能是这一情况。为除tag的融合蛋白的活性检测过吗？

o*42015-06-19 07:06

17 楼

don't shake/rock your tube when you are doing digestion.

e*s2015-06-19 07:06

18 楼

什么是DSF?
和inhibitor binding不能说明任何问题。Peptide有时候都能binding.
含MBP的fusion蛋白有活力吗？

【在 w*****8 的大作中提到】

: 我测过切完的蛋白的DSF，是fold的，还可以和inhibitor bind
:
: tag

w*82015-06-19 07:06

19 楼

就是Thermal shift assay。我测过MBP fusion 蛋白的酶活性，是active的

【在 e****s 的大作中提到】

: 什么是DSF?
: 和inhibitor binding不能说明任何问题。Peptide有时候都能binding.
: 含MBP的fusion蛋白有活力吗？

w*82015-06-19 07:06

20 楼

yes I did rock it during digestion. Why does this hurt?

【在 o*****4 的大作中提到】

: don't shake/rock your tube when you are doing digestion.