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YFP冰冻切片

YFP冰冻切片# Biology - 生物学

m*r2012-07-12 07:07

1 楼

我尝试了培育倭瓜，黄瓜，苦瓜，先浸种，再用湿巾崔苗，出了白胚之后就移到土里
，结果没有一个成功的，倭瓜露了点绿之后进展非常缓慢，至今都没有展开一片叶子，
黄瓜露了绿之后石化，后来发现土里面的部分都已经烂掉了，光剩下土面上的绿芽在骗
人，苦瓜只露了点黄，也石化了。
是不是我的方法不对啊？请大侠指点。

m*u2012-07-12 07:07

2 楼

用的Cre YFP reporter mice.想观察YFP+细胞在皮肤分布情况。4%PFA固定后镜下看发
现有自发荧光。也可能YFP有淬灭，很难区分。求哪位大佬给一个好用的protocol。包
子酬谢。

L*M2012-07-12 07:07

3 楼

temperature??

s*y2012-07-12 07:07

4 楼

直接用组织切片看荧光蛋白很难的，因为背景很强。一般都是用荧光蛋白的抗体来
检测，而不是直接看荧光蛋白。

【在 m*****u 的大作中提到】

: 用的Cre YFP reporter mice.想观察YFP+细胞在皮肤分布情况。4%PFA固定后镜下看发
: 现有自发荧光。也可能YFP有淬灭，很难区分。求哪位大佬给一个好用的protocol。包
: 子酬谢。

m*r2012-07-12 07:07

5 楼

放在外面晒太阳，温度是20几度

z*u2012-07-12 07:07

6 楼

推荐JAX的 ZsGreen flox 和 TdTomato flox. Allen Institute的Hongkui Zeng建的。
都是非常好的fluorescent reporter. 能直接看到荧光。

T*m2012-07-12 07:07

7 楼

建议你看看我的关于育苗的博文。
http://www.mitbbs.com/pc/pccon.php?id=11001&nid=265711

m*u2012-07-12 07:07

8 楼

已经用了YFP,不想再花时间构建另外品系。不过谢谢建议

【在 z****u 的大作中提到】

: 推荐JAX的 ZsGreen flox 和 TdTomato flox. Allen Institute的Hongkui Zeng建的。
: 都是非常好的fluorescent reporter. 能直接看到荧光。

m*r2012-07-12 07:07

9 楼

我突然发现我可能把种子埋进土里的时候放倒了，我把露白的那头朝上是不是不对啊？

m*u2012-07-12 07:07

10 楼

是么？我做flow cytometry区别还是很明显的。

【在 s******y 的大作中提到】

: 直接用组织切片看荧光蛋白很难的，因为背景很强。一般都是用荧光蛋白的抗体来
: 检测，而不是直接看荧光蛋白。

m*r2012-07-12 07:07

11 楼

谢谢游士，其实我其他的辣椒和西红柿都长得挺好的，就是这个瓜类全失败了

【在 T*******m 的大作中提到】

: 建议你看看我的关于育苗的博文。
: http://www.mitbbs.com/pc/pccon.php?id=11001&nid=265711

z*u2012-07-12 07:07

12 楼

flowcytometry敏感得多。
反正到现在为止，除了Hongkui Zeng建的那几个REPORTER,别的没哪个reporter能在我
研究的组织里有足够强的直接荧光。

l*n2012-07-12 07:07

13 楼

我直接放到土里，每天早晚浇水，都发芽了，也是新手.

m*u2012-07-12 07:07

14 楼

多谢。看来只能染抗体了。

【在 z****u 的大作中提到】

: flowcytometry敏感得多。
: 反正到现在为止，除了Hongkui Zeng建的那几个REPORTER,别的没哪个reporter能在我
: 研究的组织里有足够强的直接荧光。

m*r2012-07-12 07:07

15 楼

你是怎么放的，是横着放还是竖着放？

【在 l*******n 的大作中提到】

: 我直接放到土里，每天早晚浇水，都发芽了，也是新手.

s*y2012-07-12 07:07

16 楼

对，而且flowcytometry 都是把细胞打散了单个单个的跑过去，所以背景非常低
（背景就是缓冲液了，能有多少自发荧光？）。
而组织里面的话，一大堆有自发荧光的东西在那里摆着，别的不说，光是血液里的
红细胞就能让人欲哭无泪，荧光太强了！

【在 z****u 的大作中提到】

: flowcytometry敏感得多。
: 反正到现在为止，除了Hongkui Zeng建的那几个REPORTER,别的没哪个reporter能在我
: 研究的组织里有足够强的直接荧光。

l*n2012-07-12 07:07

17 楼

这就是问题所在。那个白点是根。
不过可能还是有希望的。

【在 m*********r 的大作中提到】

: 我突然发现我可能把种子埋进土里的时候放倒了，我把露白的那头朝上是不是不对啊？

D*a2012-07-12 07:07

18 楼

Hongkui Zeng的TdTomato flox. 确实很强，我们建了个全身敲除的positive对照系，
大白天老鼠都是红的，都不用做genotyping。

T*42012-07-12 07:07

19 楼

我的瓜果都是直播的，
苦瓜从来没发出芽来过

m*u2012-07-12 07:07

20 楼

求推荐个好用的YFP抗体。谢谢

m*r2012-07-12 07:07

21 楼

我说嘛，我今天仔细观察了就是这个原因。
不过这种子也够笨的，也不会再土里转个弯，直接钻出来了

【在 l*n 的大作中提到】

: 这就是问题所在。那个白点是根。
: 不过可能还是有希望的。

s*y2012-07-12 07:07

22 楼

Clontech 的不错，就是有点贵，要省着用

【在 m*****u 的大作中提到】

: 求推荐个好用的YFP抗体。谢谢

j*p2012-07-12 07:07

23 楼

翻开看一下给调个头？
我家一个毛豆种子就是往下长的，我给纠正了一下，那个杆儿转了个圈长上来了。

【在 m*********r 的大作中提到】

: 我说嘛，我今天仔细观察了就是这个原因。
: 不过这种子也够笨的，也不会再土里转个弯，直接钻出来了

h*n2012-07-12 07:07

24 楼

能给个JAX的链接或者号码吗? 谢谢.

【在 z****u 的大作中提到】

: flowcytometry敏感得多。
: 反正到现在为止，除了Hongkui Zeng建的那几个REPORTER,别的没哪个reporter能在我
: 研究的组织里有足够强的直接荧光。

m*u2012-07-12 07:07

25 楼

查了一下，发现有好多。有的是做western和IP的，老大能不能好人做到底，给个cat
no或具体名字？那个dsred的抗体能用么？clontech给的表上是TBD, 有promotion

【在 s******y 的大作中提到】

: Clontech 的不错，就是有点贵，要省着用

s*y2012-07-12 07:07

26 楼

等我一会去看看。。。

【在 m*****u 的大作中提到】

: 查了一下，发现有好多。有的是做western和IP的，老大能不能好人做到底，给个cat
: no或具体名字？那个dsred的抗体能用么？clontech给的表上是TBD, 有promotion

s*y2012-07-12 07:07

27 楼

632381 或者632380 都可以。他们正好在打折，要买赶快买：）

【在 m*****u 的大作中提到】

l*12012-07-12 07:07

28 楼

Water world 被轰出水来啦哈
sunny 这身装束
BTW sunny 把人家岩佐mm PI 收成压寨的如何
搞的都是激动蛋白类哈
Janet Iwasa received her Ph.D. from the University of California, San
Francisco working on actin cytoskeleton dynamics with Dyche Mullins.
she joined the faculty at Harvard Medical School in 2008.
http://cellbio.med.harvard.edu/faculty/iwasa/

【在 s******y 的大作中提到】

: 632381 或者632380 都可以。他们正好在打折，要买赶快买：）

z*u2012-07-12 07:07

29 楼

tdtomato Jax 007909
zsgreen Jax007906

【在 h********n 的大作中提到】

: 能给个JAX的链接或者号码吗? 谢谢.

h*n2012-07-12 07:07

30 楼

thanks

【在 z****u 的大作中提到】

: tdtomato Jax 007909
: zsgreen Jax007906

h*n2012-07-12 07:07

31 楼

thanks

【在 s******y 的大作中提到】

: 632381 或者632380 都可以。他们正好在打折，要买赶快买：）

d*d2012-07-12 07:07

32 楼

PFA处理会减弱荧光蛋白的信号，但不会完全淬灭。其结果就是强的变弱，弱的变成看
不见。当然为了排除自发荧光，可以用GFP的抗体（我们用的是Invitrogen 的rabbit
antibody， 1：300 稀释），而且用不同于绿色的conjugate(比如说红色）。

【在 m*****u 的大作中提到】

m*u2012-07-12 07:07

33 楼

多谢。我这是自身免疫病老鼠，皮肤可能有autoantibodies deposition。用鼠抗可能
背景会很高。有合适的rabbit或rat抗体么？

【在 s******y 的大作中提到】

: 632381 或者632380 都可以。他们正好在打折，要买赶快买：）

s*y2012-07-12 07:07

34 楼

人家是大牛之后，怎么会看得上我们这些旁门左道出来的吊丝。

【在 l**********1 的大作中提到】

: Water world 被轰出水来啦哈
: sunny 这身装束
: BTW sunny 把人家岩佐mm PI 收成压寨的如何
: 搞的都是激动蛋白类哈
: Janet Iwasa received her Ph.D. from the University of California, San
: Francisco working on actin cytoskeleton dynamics with Dyche Mullins.
: she joined the faculty at Harvard Medical School in 2008.
: http://cellbio.med.harvard.edu/faculty/iwasa/

s*y2012-07-12 07:07

35 楼

大部分polyclonal anti-GFP 抗体也能识别 YFP的。

【在 m*****u 的大作中提到】

: 多谢。我这是自身免疫病老鼠，皮肤可能有autoantibodies deposition。用鼠抗可能
: 背景会很高。有合适的rabbit或rat抗体么？