求助 loxp,Lonely Loxp, target Exon, etc - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

求助 loxp,Lonely Loxp, target Exon, etc

求助 loxp,Lonely Loxp, target Exon, etc# Biology - 生物学

B*12012-08-14 07:08

1 楼

《花千骨》火了一个夏季，虽说对这类玛丽苏仙侠剧也就无聊消遣看看罢了，戏
里剧外的撕逼大战一波接一波似乎这才是这类剧的重点。先不说这几个男人杀阡陌，东
方，白子画这几个优秀男人怎么就被花千骨这样一个傻白甜吸引，本来这类剧这就不是
重点。玛丽苏文的行文逻辑就是这样，认真你就输了。
花千骨要大结局了，所有女人都以为自己是花千骨，其实是紫熏
其实整个故事就讲了一个女人强大的YY意念，讲几个优秀的各类型的男人，如何为
了自己神魂颠倒，不顾一切。从侧面来说，男人真博爱，女人的意念真强大。那么多萝
卜白菜，偏偏种死一颗。不过除了花千骨这个女人意淫出来的被爱的对象，另外一个就
形成鲜明对比的则是紫熏这个被自己爱的人嫌弃，专门折磨爱自己男人的可悲女人。
整天不厌其烦的对着一个对自己冷若冰霜的白子画，每天自作多情的为之神魂颠倒
。却对爱自己爱的死去活来的男人，直接无视。从这点来说，得不到的才是最好的，作
为女性视觉可能更执着，比之男人更铁了心，毕竟现实中有句话说的好，男人是下半身
动物，自然精神的折磨更轻于女性。
写到这已经忘了这个男人的名字，其他男人如污垢、东华，虽然戏份比较少也还能
记上名字，可见在男人看来这样一个男人真的是太寒碜了，寒碜的不想将这样一个男人
视为男人。或许这本来就是女人意淫出来的必须要对女人这样的假象。
花千骨这个被女人整天痴心妄想要成为的女人，其实不过是女人的意念；而紫熏才
是女人在现实生活中为爱而伤的真实一面。
对比两个女人爱情意念虚构出来的两个人物，你会发现，这两个人对比实在是太鲜
明了。花千骨所有剧里的优秀男人都围绕着这个傻白甜小妞，没来由的，一出场东方就
叫她娘子，也是没来由的杀阡陌一出场，傻白甜的花千骨就一句混淆视听的姐姐称呼，
和一个主动的投怀送抱，就征服了霸气凌辱的杀阡陌。这个情节，女人的意淫欲念之强
大，无所不及。这或许就是玛丽苏文，在理性与逻辑下，爱情关系里的最为一厢情愿的
悖论。
再来看看，紫熏这个活了不知多久的老女人。想必五大上仙拯救苍生时，紫熏也如
今日的花千骨一般，受众人的爱慕。如今回到几百年后的现实是，傻白甜的花千骨成功
上位。白字画这个虚伪的男人，面对一个深爱着自己的女人，无动于衷了几百年。而看
到小小花千骨居然能够将杀阡陌、东方这样的男人彻底征服，而自己又是他的徒弟。很
难不令人猜测，一向冰冷的白子画，对花千骨的所谓爱情，不是因为雄性动物之间的争
雄之心，嫉妒之心在作祟。
而紫熏这个女人透露着女人在爱情中的自私。对爱自己的人怎么都无动于衷，甚至
当为她耗尽生命也只能换来她短暂的忏悔与内疚，不过多久，又将爱自己的人的所有付
出抛之脑后。女人对爱自己而自己不爱的男人的绝情由此可见！而同时紫熏在白子画那
里得到的还是一如既往的冷漠与不削。女人何故于此！在爱与被爱中煎熬，这或许就是
女人所乐意品尝的爱情滋味与自我矛盾。
花千骨是女人的梦，紫熏照进现实，还原女人的爱情观。生活中没有几个女人是花
千骨，倒是有千千万万个紫熏。

r*g2012-08-14 07:08

2 楼

日本上百名“寿星”失踪
随着加藤和古谷房不幸遭遇的披露，日本的媒体和地方政府开始对百岁以上老人的
生活状况展开紧锣密鼓的调查，越来越多令人震惊的情况浮出水面。
《朝日新闻》发现12名百岁以上老人行踪成谜。《读卖新闻》发现了15名这样的百
岁老人，《每日新闻》则报道称，仅该报掌握的情况就表明，日本各地至少有18名百岁
以上老人失踪。日本历来以长寿闻名，仅东京就有约2500名登记在案的百岁以上老人。
东京的官员们目前正试图与这些老人安排会面。
在日本西部城市神户，官员表示截至7月底该市登记在案的847名百岁以上老人中有
105人行踪不明。神户市政府官员说：“本市已经开始对这105名百岁老人的状况展开调
查。”这些老人如果都还健在，他们中有些人的年纪甚至比日本官方承认的最长寿者、
113岁的佐贺县居民长谷川都要大。一名老年妇女按照其登记的出生日期算甚至已经有
125岁了。
在大阪，857名登记在案的百岁老人中有64人不知所踪。当地官员8月5日证实说，
大阪市一名登记年龄为127岁的老人实际上在1966年就已去世。北九州市政府也表示，
该市至少有10名百岁老人行踪不明。

y*u2012-08-14 07:08

3 楼

常听到一个说法，就是如果loxp flanked的exon太大，就要小心只有一个loxp重组进去
，另一个loxp见鬼了的说法
但从另一方面说，同源重组应该是高度敏感的，loxp 30bp的不同很难想象会被
cellular machinery 识别为同源臂。
总而言之，多长的exon会bring in这个风险呢？
background是我要设计一个flank了300bp exon的loxp allelle
想在distal loxp那里设计一个 digetion site，被认为多此一举

e*d2012-08-14 07:08

4 楼

赞，评论得犀利彻骨。
看来本文作者与师太一样，都钟情于一个易于遗忘的名字——檀梵。

【在 B******1 的大作中提到】

: 《花千骨》火了一个夏季，虽说对这类玛丽苏仙侠剧也就无聊消遣看看罢了，戏
: 里剧外的撕逼大战一波接一波似乎这才是这类剧的重点。先不说这几个男人杀阡陌，东
: 方，白子画这几个优秀男人怎么就被花千骨这样一个傻白甜吸引，本来这类剧这就不是
: 重点。玛丽苏文的行文逻辑就是这样，认真你就输了。
: 花千骨要大结局了，所有女人都以为自己是花千骨，其实是紫熏
: 其实整个故事就讲了一个女人强大的YY意念，讲几个优秀的各类型的男人，如何为
: 了自己神魂颠倒，不顾一切。从侧面来说，男人真博爱，女人的意念真强大。那么多萝
: 卜白菜，偏偏种死一颗。不过除了花千骨这个女人意淫出来的被爱的对象，另外一个就
: 形成鲜明对比的则是紫熏这个被自己爱的人嫌弃，专门折磨爱自己男人的可悲女人。
: 整天不厌其烦的对着一个对自己冷若冰霜的白子画，每天自作多情的为之神魂颠倒

i*l2012-08-14 07:08

5 楼

这个玩笑开大了
日本人均寿命估计要下降1-2岁了

【在 r*******g 的大作中提到】

: 日本上百名“寿星”失踪
: 随着加藤和古谷房不幸遭遇的披露，日本的媒体和地方政府开始对百岁以上老人的
: 生活状况展开紧锣密鼓的调查，越来越多令人震惊的情况浮出水面。
: 《朝日新闻》发现12名百岁以上老人行踪成谜。《读卖新闻》发现了15名这样的百
: 岁老人，《每日新闻》则报道称，仅该报掌握的情况就表明，日本各地至少有18名百岁
: 以上老人失踪。日本历来以长寿闻名，仅东京就有约2500名登记在案的百岁以上老人。
: 东京的官员们目前正试图与这些老人安排会面。
: 在日本西部城市神户，官员表示截至7月底该市登记在案的847名百岁以上老人中有
: 105人行踪不明。神户市政府官员说：“本市已经开始对这105名百岁老人的状况展开调
: 查。”这些老人如果都还健在，他们中有些人的年纪甚至比日本官方承认的最长寿者、

m*52012-08-14 07:08

6 楼

300bp确实没什么好担心的，要是中了楼主买彩票吧

k*e2012-08-14 07:08

7 楼

都是家属隐瞒继续骗养老金地

【在 i***l 的大作中提到】

: 这个玩笑开大了
: 日本人均寿命估计要下降1-2岁了

D*a2012-08-14 07:08

8 楼

300bp没问题，但是设计个digetion site也不麻烦，还可以留着用，何乐而不为

O*n2012-08-14 07:08

9 楼

恐怖

【在 r*******g 的大作中提到】

y*u2012-08-14 07:08

10 楼

谢谢鼠女王！

【在 D*a 的大作中提到】

: 300bp没问题，但是设计个digetion site也不麻烦，还可以留着用，何乐而不为

m*52012-08-14 07:08

11 楼

我觉得既然没问题可以不用设，楼主的情况也许没交代清楚，兴许他的loxp在敏感区域
，能减少改变就得尽量减少？(比如5,UTR, splicing site)

【在 D*a 的大作中提到】

: 300bp没问题，但是设计个digetion site也不麻烦，还可以留着用，何乐而不为

D*a2012-08-14 07:08

12 楼

以后southern不用切么？
我也没造过老鼠，都是听周围造老鼠的说的。
我们用的floxed的老鼠两个loxp中间800bp左右，exon只有不到400，剩下的400是两边
各一段intron。两边都有几个酶切位点，不过我们的不在 5,UTR，在不在splicing
site就不知道了，从没有任何表型没有蛋白质降低来看应该是不在splicing site。
关键老鼠这玩意儿没见到最后跟cre交配的KO谁也不敢说没问题啊。

【在 m******5 的大作中提到】

: 我觉得既然没问题可以不用设，楼主的情况也许没交代清楚，兴许他的loxp在敏感区域
: ，能减少改变就得尽量减少？(比如5,UTR, splicing site)

m*52012-08-14 07:08

13 楼

我的意思是楼主不用担心loxp丢掉，至于能不能用是另外一回事
一听到自己不用做老鼠的就妒忌得不行……做construct打ES再等germline
transmission 最后等表达等phenotype多折腾人啊！！！
设计那么多酶切位点太夸张了，我觉得只要PCR sequence一下就可以了
800 bp那个floxed region他们设计酶切位点是precautions?最后有发现只有一个loxp
的克隆么？我看文献里报道了这种情况的都是2k floxed region才发生的。如果800
bp能发生岂不是说明short arm只要800bp就能做targeting? (当然也可能，不过300bp
我觉得如果发生了可以发个genesis报告了)
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mo100159.
鼠女王能帮忙下载一个paper么？

【在 D*a 的大作中提到】

: 以后southern不用切么？
: 我也没造过老鼠，都是听周围造老鼠的说的。
: 我们用的floxed的老鼠两个loxp中间800bp左右，exon只有不到400，剩下的400是两边
: 各一段intron。两边都有几个酶切位点，不过我们的不在 5,UTR，在不在splicing
: site就不知道了，从没有任何表型没有蛋白质降低来看应该是不在splicing site。
: 关键老鼠这玩意儿没见到最后跟cre交配的KO谁也不敢说没问题啊。

D*a2012-08-14 07:08

14 楼

汗。。。叫得太那啥了吧。。。
这篇在pubmed自己的数据库是free，你可以从pubmed过去，我email给你也行。
我们老鼠是不用做了，买cre再跟cre交配也要交一年啊。。。

loxp
300bp

【在 m******5 的大作中提到】

: 我的意思是楼主不用担心loxp丢掉，至于能不能用是另外一回事
: 一听到自己不用做老鼠的就妒忌得不行……做construct打ES再等germline
: transmission 最后等表达等phenotype多折腾人啊！！！
: 设计那么多酶切位点太夸张了，我觉得只要PCR sequence一下就可以了
: 800 bp那个floxed region他们设计酶切位点是precautions?最后有发现只有一个loxp
: 的克隆么？我看文献里报道了这种情况的都是2k floxed region才发生的。如果800
: bp能发生岂不是说明short arm只要800bp就能做targeting? (当然也可能，不过300bp
: 我觉得如果发生了可以发个genesis报告了)
: http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mo100159.
: 鼠女王能帮忙下载一个paper么？

m*52012-08-14 07:08

15 楼

刚造了个老鼠还要再买allelle配两个上去的苦命默默飘过……
你能下载到final version么？NIH manuscript 看得很难受
w****[email protected]
Thanks!!!!!!!!!!!

【在 D*a 的大作中提到】

: 汗。。。叫得太那啥了吧。。。
: 这篇在pubmed自己的数据库是free，你可以从pubmed过去，我email给你也行。
: 我们老鼠是不用做了，买cre再跟cre交配也要交一年啊。。。
:
: loxp
: 300bp

D*a2012-08-14 07:08

16 楼

不好意思啊，我也只能下到NIH的版本。。。

【在 m******5 的大作中提到】

: 刚造了个老鼠还要再买allelle配两个上去的苦命默默飘过……
: 你能下载到final version么？NIH manuscript 看得很难受
: w****[email protected]
: Thanks!!!!!!!!!!!

m*52012-08-14 07:08

17 楼

Thank you anyway!

【在 D*a 的大作中提到】

: 不好意思啊，我也只能下到NIH的版本。。。

r*y2012-08-14 07:08

18 楼

1. floxed 300 bp should not present any problem for recombination;
2. introducing a disgestion site is a good and reasonable design for future
southern verification, if there is no endogenous restriction site(s)
available for southern strategy;
3. you should pay more attention to the design of the arm length. Based on
my experience, over 5000bp/arm is recommended; shorter than this will reduce
the specific recombination efficiency, although some reports also suggested
that a shorter arm also worked in their cases, but you do not know the
positive rate in those reports;
4. it would be better if you could flank the neo selection cassette with Frp
sites, and you may remove it once you have floxed animals. sometimes the
presence of this cassette, although it is in the intron, will reduce the
expression of the target gene. However, if it is the case, you may use it as
a hypomorphic allele to study dose-dependent impact of this gene on
particular functions. it all depends on what you need;
5. concerning whether using PCR or shouthern for screening, Southern is much
more reliable than PCR. To be on the safe side, a good strategy is that to
use PCR for the initial screening of positive ES clones, followed by
southern screening for those PCR-positive clones. This will reduce the
workload for the southern blot, and also eliminate the false positive clones
identified by PCR.