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分子生物学问题求救
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分子生物学问题求救# Biology - 生物学
J*t
1
【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
发信人: Jessicat (smiley cat), 信区: SanDiego
标 题: 一个工作机会
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 3 14:47:21 2011, 美东)
帮朋友发的,感兴趣的请回我站内信箱。
Senior Technologist
Job Description
This challenging position will allow the candidate to gain expertise in
state-of-the-art wireless multimedia technologies, in a fast growing high
tech startup deploying video optimization systems for network operators and
content providers. The candidate will participate in the research and
development of a new technology platform applicable to a diverse set of next
generation wireless devices. The candidate will be the lead architect of
the solution, in collaboration with senior technologists. The position will
also offer opportunities to participate in customer and partnership
discussions, and participate in industry forums and standards meetings.
Essential Job Functions
Development of algorithms and architectures for new technologies.
Testing, analysis, and validation of the technology prototypes.
Participation in technology evaluation and partnership initiatives.
Interaction with customers and various groups in the company as needed, to
architect and deliver compelling products to customers.
Requirements
7+ Years of experience in innovating, conceptualizing, designing and
architecting new products and developing prototypes.
Experience in the entire software development life cycle from concept to
testing / maintenance.
Expertise in C/C++ programming required.
Familiarity with embedded development platforms such as Windows Directshow/
WMF, Android Multimedia, iOS Multimedia or BREW.
Familiarity with development on Linux/Windows, to develop robust client-
server solutions for the desktop as well as embedded devices.
Knowledge of any of the following Scripting languages: Perl, PHP, Shell
scripting.
Excellent problem solving skills required.
Experience in one or more of the following technologies is desirable:
o Network delivery protocols (RTSP/RTP/RTCP,HTTP,RTMP,SIP,AHLS)
o Network programming for TCP or UDP protocols.
o Understanding of Mobile internet concepts.
o Audio/video compression technologies (MPEG,H.264,AAC,VP8) and formats (MP4
/FLV/MPEG2TS).
o DRM technologies for secure media management
Experience with some embedded platform such as Qualcomm SnapDragon or TI –
OMAP
Candidate Qualifications
Ph.D. or MS in EE/ECE or Computer Science
6-9 years of industrial experience
Willing to relocate to San Diego, CA area
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d*9
2
本人有过几年的分子生物学的基础,原来作克隆的时候没有遇到过什么大问题,但都是
低于1Kb的PCR产物。但是最近换了一个实验室,一系列分子实验都严重受挫,我也不知
道是什么原因,实在没有招了,多谢高人指点
都是1500bp左右的PCR片断,我在设计引物的时候有在5‘端加了5个bp,PCR都一次能扩
出来,clean-up后酶切,之后再跑胶clean-up,跑了胶确定有条带,还挺亮的。于是跟
相同酶切,CIP处理后,跑胶clean-up的载体相连,室温过夜,也试过16度过夜,但是
transform到商品化的两种不同公司来的感受态细胞之后,都没有克隆出现,几个PCR产
物都是一样的问题
开始觉得可能是PCR产物没有酶切好,尝试先将PCR产物与T载体连接,transform之后也
没有克隆出现
是哪儿有问题,我该如何做?多谢!
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J*t
3
看上去要求很多,其实关键是C/C++, video, network protocols(TCP...)
他们刚拿了一大笔funding,有几个职位在招人,有兴趣的童鞋试试吧。请回我站内信
箱。

and

【在 J******t 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
: 发信人: Jessicat (smiley cat), 信区: SanDiego
: 标 题: 一个工作机会
: 发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 3 14:47:21 2011, 美东)
: 帮朋友发的,感兴趣的请回我站内信箱。
: Senior Technologist
: Job Description
: This challenging position will allow the candidate to gain expertise in
: state-of-the-art wireless multimedia technologies, in a fast growing high
: tech startup deploying video optimization systems for network operators and

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b*y
4
wrong resistance?
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d*9
5
肯定没有

【在 b******y 的大作中提到】
: wrong resistance?
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X*n
6
try CPEC cloning or SLIC cloning.
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C*S
7
不需要跑胶纯化。
pcr产物---PCR purification---酶切---PCR purification
载体---CIP---PCR purification
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d*9
8
这是什么?请求详解

【在 X***n 的大作中提到】
: try CPEC cloning or SLIC cloning.
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H*i
9
你要别人帮你找问题,你不能写得这么笼统,具体的细节都要写出来
CPEC就是用PCR完成最后一步环化(引物长度的overlap),slic是用T4 DNA
polymerase切掉3'->5' 然后overlap部分互相结合环化,如果要高产率得话,可以
Gibson assembly。具体方法网上自己找好了,都不难。这三种方法引物也是一样的,
一个有问题可以试试另一种。
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g*n
10
1.跑胶clean-up会污染什么东西,抑制ligase. PCR products只好跑胶clean-up (
Qiagen kit). 载体就不必了.
2.酶切位点外要多出3-5个核苷,以确保酶切。
3.如果用的是Taq,酶切位点突变(可能性极小)。
TA也不成,看来2,3都不大可能是问题。但是,不妨考虑。
试试TA TOPO。然后再切下来装到你要的载体上。
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z*3
12
TA does not work? Is the PCR product has blunt end? Do you use proofreading
polymerase?
If it is blunt end, follow protocol to Add 3′ A-Overhangs
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H*a
13
我曾遇到跟你类似的情况,也是新去一个实验室,也是从前的vector构建老手,但就是
怎么也转不出克隆来,找了无数原因。后来发现了一个极低级的,致命的错误。
我以前的实验室,LB板是技术员制备的,到了新实验后,LB板要自己制备,问题就出在
制备LB板上。
LB Agar应该直接溶解在water里,而我想当然地认为是agar,就溶解到LB溶液了。结果
就是,转化后怎么也不出克隆,24小时候能见到很小的克隆,挑出来摇菌都摇不起来。
你的原因也许不一定一样,但我的建议是,仔细检查一遍每个细节,哪怕最简单的细节
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g*j
14
是不是DNA回收试剂盒的问题
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q*7
15
你的连接片段,PCR和载体可能混有洗液。洗液可以很大的影响抑制连接酶活性。你用
Nanodrop测片段浓度时,如果260/230比值很低,230有个大峰就说明洗液很
多。你可以试一下这个公司的gel extraction/PCR purification二合一KIT,所提取的
片段中没有洗液。可以提高连接和
克隆效率。
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
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x*e
16
是不是CIAP去磷酸化过头了。我在这边也有这种问题,CIAP似乎不太好用。
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b*y
17
I never do CIP step. no problem so far after hundreds of constructs made.
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d*9
18
多谢大家帮忙了,我在发帖之前自己也试过很多办法,但是都没有解决问题:
1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时,作500bp片断的连接,没有问题,是不是
1500bp片断还是很难连很多?
2.本身我的酶切位点外多5个核苷,应该直接酶切没有问题
3.试过不同公司的ligase,但是transform之后都没有克隆
4。试过不同公司的感受态细胞,但是都没有克隆,对于单纯的质粒,能长克隆,可见
感受态细胞和LB板应该没有问题
5.没有试过不用CIP,接下来要试试
虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的,但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
验很简单,但是一直没有出东西,郁闷!
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c*d
19
试试最后extra extension (68/72度C)时间长点,比如10分钟。我有个印象是DNA
polymerase到了template末端反应速度会慢下来,有时候会挂在上头不下来。这个在胶
上看不出来的。最后一个格外的extension时间帮助完成反应,得到一个完整DNA双链。
试试看。回来报告一下:) GOOD LUCK.
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b*e
20
试试clonetech的infusion kit吧,只需要切plasmid,PCR产物不用切,直接做连接。
非常有效,从来没有失败过。这个的PCR引物需要特别设计,可以用他们的网上的
primer design tools来设计。
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w*i
21
全部换kits
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f*9
22
会有empty vector transform的细菌长出来吗

【在 d**********9 的大作中提到】
: 本人有过几年的分子生物学的基础,原来作克隆的时候没有遇到过什么大问题,但都是
: 低于1Kb的PCR产物。但是最近换了一个实验室,一系列分子实验都严重受挫,我也不知
: 道是什么原因,实在没有招了,多谢高人指点
: 都是1500bp左右的PCR片断,我在设计引物的时候有在5‘端加了5个bp,PCR都一次能扩
: 出来,clean-up后酶切,之后再跑胶clean-up,跑了胶确定有条带,还挺亮的。于是跟
: 相同酶切,CIP处理后,跑胶clean-up的载体相连,室温过夜,也试过16度过夜,但是
: transform到商品化的两种不同公司来的感受态细胞之后,都没有克隆出现,几个PCR产
: 物都是一样的问题
: 开始觉得可能是PCR产物没有酶切好,尝试先将PCR产物与T载体连接,transform之后也
: 没有克隆出现

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t*o
23
你需要给出更多的details大家才好帮你。你用的是什么内切酶?你确定酶切一定没问
题?
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q*8
24

感受态的敏感性是不一样的,要检测感受态是否有功能,你要做的不只是阳性对照,还
要把你阳性对照里的质粒梯度稀释。
RESTRICTION ENZYME 也有讲究,NEB官网上对每个酶切位点都有评论,有的酶切位点就
是不好连。。。
另外TOPO TA真的很好用,超级快效率超级高,如果可以的话果断用TOPO的。

【在 d**********9 的大作中提到】
: 多谢大家帮忙了,我在发帖之前自己也试过很多办法,但是都没有解决问题:
: 1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时,作500bp片断的连接,没有问题,是不是
: 1500bp片断还是很难连很多?
: 2.本身我的酶切位点外多5个核苷,应该直接酶切没有问题
: 3.试过不同公司的ligase,但是transform之后都没有克隆
: 4。试过不同公司的感受态细胞,但是都没有克隆,对于单纯的质粒,能长克隆,可见
: 感受态细胞和LB板应该没有问题
: 5.没有试过不用CIP,接下来要试试
: 虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的,但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
: 验很简单,但是一直没有出东西,郁闷!

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J*a
25
强烈怀疑是片段酶切有问题。你用的什么酶?会不会有些酶需要比较多的保护碱基才能
切得动。
你也可以把你的连接体系拿去跑个电泳看看里面是什么情况。
建议把PCR片段先做TA克隆之后,再酶切回收片段做链接。
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g*9
26
还有一些可能性就是你转的片段表达了什么有毒产物,或者是片段自己粘成一团复制不
出来。
avatar
H*i
27
LZ你这么笼统的问,有问题的可能性多了去了,你应该详细写出你的步骤(包括片段
酶 载体 这些细节),现象
比如你上面提到转质粒能长,长了多少? 效率是10^8还是10^9/ug
没有克隆是怎样没有,长出来很多都是假阳性/空载体还是什么都不长
这些你都不写谁知道啥问题啊,都只能猜,有多少步骤就能猜多少可能性出来。
另外1.5K很好连,尽管我不做TA克隆,不过3-5K的片段正常连接我也没遇到过什么大问题
你提到500做出来了,长了多少?阳性率怎么样?至少提一下吧。
要么你就用上面提到的不用酶切连接的几种策略,拿到引物后第二天晚上/第三天早晨
也足够拿到克隆了。你怕操作不熟练就用上面有人提到的infusion kit这种商业化试剂
盒也可以。这个理论上只要你的PCR没问题,转化没问题(包括你的片段载体构建不会
杀死细胞)就能做出来。
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s*u
28
1. 1500bp片断应该问题不大,算中等长度的ligation,应该是可行的。
2. 五个应该够了,偶一般用的3到4个。
3. 这应该说明不是ligase的问题,很可能是insert和vector的问题。另外,注意
ligase buffer,用新的,这个容易降解。
4. good control。应该是ligation的问题。
5. 为什么要用CIP。质粒是用单一酶切的吗?如果是用的单一酶切的,可能必须使用
CIP防止自连。我们一般用两种不同酶切,这样可不用CIP处理。保证两个酶切完全的情
况下自身连接机率很小。以前用过一次CIP,效果很不好,也是不长克隆菌,有可能的
话建议避免使用。有研究表明CIP如果过度处理会部分甚至完全切掉sticky end。
另外,需要考虑一下,你这个克隆,是否对e.coli有toxic作用而使其不长或生长极缓
慢。
祝成功。
bless all!

【在 d**********9 的大作中提到】
: 多谢大家帮忙了,我在发帖之前自己也试过很多办法,但是都没有解决问题:
: 1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时,作500bp片断的连接,没有问题,是不是
: 1500bp片断还是很难连很多?
: 2.本身我的酶切位点外多5个核苷,应该直接酶切没有问题
: 3.试过不同公司的ligase,但是transform之后都没有克隆
: 4。试过不同公司的感受态细胞,但是都没有克隆,对于单纯的质粒,能长克隆,可见
: 感受态细胞和LB板应该没有问题
: 5.没有试过不用CIP,接下来要试试
: 虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的,但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
: 验很简单,但是一直没有出东西,郁闷!

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s*s
29
没仔细看帖子。
是不是有人连接前CIP了?这玩意儿处理过就很难连了,除非
100%必要,否则宁愿多筛点克隆也不要用这个

【在 s*********u 的大作中提到】
: 1. 1500bp片断应该问题不大,算中等长度的ligation,应该是可行的。
: 2. 五个应该够了,偶一般用的3到4个。
: 3. 这应该说明不是ligase的问题,很可能是insert和vector的问题。另外,注意
: ligase buffer,用新的,这个容易降解。
: 4. good control。应该是ligation的问题。
: 5. 为什么要用CIP。质粒是用单一酶切的吗?如果是用的单一酶切的,可能必须使用
: CIP防止自连。我们一般用两种不同酶切,这样可不用CIP处理。保证两个酶切完全的情
: 况下自身连接机率很小。以前用过一次CIP,效果很不好,也是不长克隆菌,有可能的
: 话建议避免使用。有研究表明CIP如果过度处理会部分甚至完全切掉sticky end。
: 另外,需要考虑一下,你这个克隆,是否对e.coli有toxic作用而使其不长或生长极缓

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H*i
30
CIP没问题,我一般酶切+CIP 1h左右,假阳性率在切下的片段很短的情况下大大降低(
有些情况能降低90%以上)。
也能得到相当数量的克隆,一般总有接近100个。
当然LZ用CIP处理PCR片段我是不明白为什么,要解决的是载体中的假阳性,对片段处理
有啥用?
另外LZ说这么笼统,看起来你的实验步骤大体都是对的(反正至少你以前也做出来过不
是么。。),这样让其他人在这瞎猜一点意思都没。你尝试解决方法也只能瞎猜。
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m*M
31
我怀疑是你最后片段里的洗液抑制了连接酶的活性。在要连接片段较大时尤其明显。有
个哥们给我推荐了一个公司的KIT,据说可以完全去掉洗液。我刚刚定了提质粒的和胶
回收的。比QIAGEN便宜多了,虽然我们学校可以拿到QIAGEN一定的折扣。还没有收到。
你也可以试一试。
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification

【在 d**********9 的大作中提到】
: 多谢大家帮忙了,我在发帖之前自己也试过很多办法,但是都没有解决问题:
: 1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时,作500bp片断的连接,没有问题,是不是
: 1500bp片断还是很难连很多?
: 2.本身我的酶切位点外多5个核苷,应该直接酶切没有问题
: 3.试过不同公司的ligase,但是transform之后都没有克隆
: 4。试过不同公司的感受态细胞,但是都没有克隆,对于单纯的质粒,能长克隆,可见
: 感受态细胞和LB板应该没有问题
: 5.没有试过不用CIP,接下来要试试
: 虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的,但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
: 验很简单,但是一直没有出东西,郁闷!

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c*r
32
不可能用CIP处理PCR片段。lz说的是CIP处理过的载体。

【在 H*******i 的大作中提到】
: CIP没问题,我一般酶切+CIP 1h左右,假阳性率在切下的片段很短的情况下大大降低(
: 有些情况能降低90%以上)。
: 也能得到相当数量的克隆,一般总有接近100个。
: 当然LZ用CIP处理PCR片段我是不明白为什么,要解决的是载体中的假阳性,对片段处理
: 有啥用?
: 另外LZ说这么笼统,看起来你的实验步骤大体都是对的(反正至少你以前也做出来过不
: 是么。。),这样让其他人在这瞎猜一点意思都没。你尝试解决方法也只能瞎猜。

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H*i
33
哦 早起没睡醒 看岔行了
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h*r
34
这个价格看着真好啊!不知道效果怎么样?QIAGEN的也不错,就是太贵了。我都想订了
。200以上免shipping fee。Zymo的怎么样?

【在 m****M 的大作中提到】
: 我怀疑是你最后片段里的洗液抑制了连接酶的活性。在要连接片段较大时尤其明显。有
: 个哥们给我推荐了一个公司的KIT,据说可以完全去掉洗液。我刚刚定了提质粒的和胶
: 回收的。比QIAGEN便宜多了,虽然我们学校可以拿到QIAGEN一定的折扣。还没有收到。
: 你也可以试一试。
: http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification

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H*i
35
zymo买那个可以6ul洗脱的kit就可以了,大得我感觉没啥优势。
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b*H
36
有一种可能性不能排除:我们实验室遇到过同样现象。
我们号称做克隆最牛,每一次都是教科书级的水平。但有一次一个学生克隆一个怎么也
做不出来,实验员上来也还不行。最后一次偶然机会,用了BL21-plys做感受态细胞,
做出来了。结果发现此蛋白对细菌剧毒,痕量的leaking expression足以杀死细胞。此
结果发在了G&D上了。
还有一种可能: 仔细检查你的引物,很可能有设计失误,一个碱基的错误就会出您这
样的结果,您懂的。如果没有设计错误,重合引物是最佳选择。
GOOD LUCK!
avatar
b*H
37
另外一个建议:
NEB的QUICK LIGASE效果奇佳,室温10分钟搞定,本人已用它搞定了上千个CONSTRUCT了
,无一失手。很不明白那么多人还在继续用老的LIGASE。我们的政策是,每天九点上班
来做PCR,下午五点下班前搞定转化,第二天就要拿板子来看结果。
avatar
W*V
38
我周一作了四个TRIP-LIGATION 克隆, 筛选都阳性. 今天又作了六个. 集我30年的分
子生物学的工作经验, 我有一套简易,有效的基因克隆方法. 无论片断大小 (>8Kb),
无论酶切类型, 无论何种载体 和感受态细胞, 全都工作,没有问题. 可惜因为版权
关系 (正在写书),其操作步骤现只能非免费提供. 该克隆方法(章节) 转让费为$100.
为证明其可信度,我可以为你作一免费克隆. 你只提供目标片断, 我在三天内交付你
克隆好的质粒. 有兴趣的话,可联系,用此邮箱.
avatar
W*V
39
我周一作了四个TRIP-LIGATION 克隆, 筛选都阳性. 今天又作了六个. 集30年的分子生
物学的工作经验, 我有一套简易,有效的基因克隆方法. 无论片断大小 (>8Kb), 无论酶
切类型, 无论何种载体 和感受态细胞, 全都工作,没有问题. 可惜因为版权关系 (正在
写书),其操作步骤现只能非免费提供. 该克隆方法(章节) 转让费为$100.为证明其可信
度,我可以为你作一免费克隆. 你只提供目标片断, 我在三天内交付你克隆好的质粒.
有兴趣的话,可联系,用此邮箱. l******[email protected]
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