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探讨实验方向# Biology - 生物学
c*1
1
我们组是做neuronal activity调节基因表达的。最近做的一个蛋白,我们认为它可以
调节 neuronal activity dependent gene expression. ChIP data也提示我们的想法
可能是对的。因为这个蛋白有 neuronal activity dependent enrichment,而且还主
要在比如Arc,fos这些基因的promoter。
现在的问题是,把这个蛋白敲掉后(大概70%),ChIP data显示,enrichment显著降低
。但是,那些 targeted neuronal activity dependent genes没有显著变化(在
neuron去极化后)。
请问,还有什么方向可以摸索么?
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A*r
2
你的意思是,这个蛋白在depolarization之后会被recruit到Arc和Fos的promoter,
但是敲掉之后,Arc和Fos的mRNA level没有变化?
有没有类似功能的蛋白可能compensate你的manipulation?
除了ChIP data之外,还有什么证据支持“认为它可以调节neuronal activity
dependent gene expression”?
这个蛋白是DNA-binding或者histone-binding么?跟transcription factor有关?
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c*1
3
你的理解是正确的。
把它同一个家族的其它基因同时敲掉后,也没有什么变化。这个蛋白是可以跟histone
结合的。目前只有ChIP data是阳性的。我们也考虑过这个蛋白的作用可能是先跟
promoter结合但是起的作用是及时关掉相关基因的表达。但是实验结果也不是很显著。
我的问题是,研究activity dependent gene expression,除了可以从开始induction
和后期的 shut down入手外,还有没有别的路径可以考虑?

【在 A**r 的大作中提到】
: 你的意思是,这个蛋白在depolarization之后会被recruit到Arc和Fos的promoter,
: 但是敲掉之后,Arc和Fos的mRNA level没有变化?
: 有没有类似功能的蛋白可能compensate你的manipulation?
: 除了ChIP data之外,还有什么证据支持“认为它可以调节neuronal activity
: dependent gene expression”?
: 这个蛋白是DNA-binding或者histone-binding么?跟transcription factor有关?

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A*r
4
不知道。。。只能瞎猜了
敲掉这个基因会不会影响histone modification?
如果还是从induction的角度的话,
有没有可能是KCl depolarization的刺激太强了,掩盖了一些细微的变化?没准用
physiology level的stimulation,能看到induction的不同?
有没有可能影响induction的快慢?Arc和c-Fos在几分钟之内就产生mRNA,敲掉这个基
因之后,没准induction变慢了(前十几分钟的mRNA变少),但是一个小时之后测mRNA
,可能看不出啥变化。
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n*y
5
你都把基因knockdown了,enrichment当然变低了。我觉得应该测knockdown之后neuron
activity的变化,那些target gene rna 是多久之后测得,就像楼上说的,可能会影
响反应速度的灵敏度。如果是结合histone,能不能测一下histone的修饰。
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c*1
6
前一段时间太忙了,没空来看论坛。今天接着讨论下。
我做了time course,从5min到4hr都做了。这些目的基因的induction的曲线变化不明
显。
你说检测histone的修饰,但是,histone的修饰,最终的readout还是gene 表达的变化
。如果现在看不到表达方面的变化,那检测histone有什么意义呢?

neuron

【在 n***y 的大作中提到】
: 你都把基因knockdown了,enrichment当然变低了。我觉得应该测knockdown之后neuron
: activity的变化,那些target gene rna 是多久之后测得,就像楼上说的,可能会影
: 响反应速度的灵敏度。如果是结合histone,能不能测一下histone的修饰。

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m*m
7
not enough kd. try harder.

【在 c****1 的大作中提到】
: 我们组是做neuronal activity调节基因表达的。最近做的一个蛋白,我们认为它可以
: 调节 neuronal activity dependent gene expression. ChIP data也提示我们的想法
: 可能是对的。因为这个蛋白有 neuronal activity dependent enrichment,而且还主
: 要在比如Arc,fos这些基因的promoter。
: 现在的问题是,把这个蛋白敲掉后(大概70%),ChIP data显示,enrichment显著降低
: 。但是,那些 targeted neuronal activity dependent genes没有显著变化(在
: neuron去极化后)。
: 请问,还有什么方向可以摸索么?

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A*u
8
请问 你的ChIP是在培养的细胞做的吗
什么细胞?

【在 c****1 的大作中提到】
: 我们组是做neuronal activity调节基因表达的。最近做的一个蛋白,我们认为它可以
: 调节 neuronal activity dependent gene expression. ChIP data也提示我们的想法
: 可能是对的。因为这个蛋白有 neuronal activity dependent enrichment,而且还主
: 要在比如Arc,fos这些基因的promoter。
: 现在的问题是,把这个蛋白敲掉后(大概70%),ChIP data显示,enrichment显著降低
: 。但是,那些 targeted neuronal activity dependent genes没有显著变化(在
: neuron去极化后)。
: 请问,还有什么方向可以摸索么?

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c*1
9
用的是shRNA,设计了好几个。KD的效率至少有70%。
难道要弄loxP+CRE? 或者null?

【在 m****m 的大作中提到】
: not enough kd. try harder.
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c*1
10
ChIP是在Primary Neuron里做的。

【在 A******u 的大作中提到】
: 请问 你的ChIP是在培养的细胞做的吗
: 什么细胞?

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