少量细胞PCR方法请教# Biology - 生物学
h*d
1 楼
Freedom这个季度有5% in airline, 不知道用来share US airways 的miles 算不算？
有大牛知道吗？
谢谢！
有大牛知道吗？
谢谢！
b*g
2 楼
马上要海归，但是手头的房子是个头疼的事情
3年多前买的房子，现在找了一个Agent来看了，建议Listing的价格比我的贷款余额还
少5000$.
估计实际成交价格比这更低了。
老婆还想留着这房子，认为卖了亏大了。但是出租的话每个月还要亏损500块左右。而
且在国内也不好操作.
我的选择是卖掉. 觉得自己卖不划算，除了要倒找银行钱外，还要付agent fee什么的
。所以在考虑Short Sell。 如果版上各位有什么建议，或者知道Short Sell如果操作
，请指点。多谢。
3年多前买的房子，现在找了一个Agent来看了，建议Listing的价格比我的贷款余额还
少5000$.
估计实际成交价格比这更低了。
老婆还想留着这房子，认为卖了亏大了。但是出租的话每个月还要亏损500块左右。而
且在国内也不好操作.
我的选择是卖掉. 觉得自己卖不划算，除了要倒找银行钱外，还要付agent fee什么的
。所以在考虑Short Sell。 如果版上各位有什么建议，或者知道Short Sell如果操作
，请指点。多谢。
f*g
3 楼
要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
谢谢
请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
谢谢
z*n
4 楼
只能等待小白鼠实验报告了
h*n
5 楼
是不是一开始short sale的话，你就不用付月供了，白住到卖掉或你走人或银行
forclosure.
forclosure.
i*0
6 楼
你有email么？我可以给你一个protocol。
f*s
7 楼
应该是point charge吧，如果是肯定不算，我是等报消息，实在不行就准备用神卡
c*1
8 楼
Yes,find a agent.short sell is best
w*d
9 楼
我也想要，请给也发一份好吗？
多谢！
多谢！
z*i
10 楼
应该是不算的 是points.com charge的
D*a
11 楼
你的pcr产物要干什么？
我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
h*z
12 楼
请问定一张中美往返票费用是40（phone) + 50(processing fee) = 90, 还是还有别的
费用？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
【在 z*******i 的大作中提到】
: 应该是不算的 是points.com charge的
费用？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
【在 z*******i 的大作中提到】
: 应该是不算的 是points.com charge的
l*y
13 楼
这个数量的细胞pcr不难，简单点的用epicentre的quickextract solution，泡泡细胞就
可以直接用来pcr
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
可以直接用来pcr
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
h*z
14 楼
昨天买的，写的是 point us air miles
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
【在 z*******i 的大作中提到】
: 应该是不算的 是points.com charge的
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
【在 z*******i 的大作中提到】
: 应该是不算的 是points.com charge的
s*2
15 楼
genotyping时用的细胞数大概是什么数量级的？没做过，请教一下。
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
l*i
16 楼
这个算还是不算？
【在 h**z 的大作中提到】
: 昨天买的，写的是 point us air miles
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
【在 h**z 的大作中提到】
: 昨天买的，写的是 point us air miles
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
D*a
17 楼
一片耳朵洞，消化以后还有一大片，肉眼看不出跟消化前有什么区别。
以前用老鼠尾巴，也差不多。
【在 s**2 的大作中提到】
: genotyping时用的细胞数大概是什么数量级的？没做过，请教一下。
以前用老鼠尾巴，也差不多。
【在 s**2 的大作中提到】
: genotyping时用的细胞数大概是什么数量级的？没做过，请教一下。
h*d
18 楼
thanks.
【在 h**z 的大作中提到】
: 昨天买的，写的是 point us air miles
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
【在 h**z 的大作中提到】
: 昨天买的，写的是 point us air miles
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
f*g
19 楼
测序，
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
D*0
20 楼
Confirmed NO.
Got my Freedom statement today, "point us air miles" doesn't count as 5%.
Got my Freedom statement today, "point us air miles" doesn't count as 5%.
f*g
21 楼
谢谢了
胞就
【在 l***y 的大作中提到】
: 这个数量的细胞pcr不难，简单点的用epicentre的quickextract solution，泡泡细胞就
: 可以直接用来pcr
胞就
【在 l***y 的大作中提到】
: 这个数量的细胞pcr不难，简单点的用epicentre的quickextract solution，泡泡细胞就
: 可以直接用来pcr
l*i
22 楼
很不幸的消息， 只能用神卡了
【在 D*******0 的大作中提到】
: Confirmed NO.
: Got my Freedom statement today, "point us air miles" doesn't count as 5%.
【在 D*******0 的大作中提到】
: Confirmed NO.
: Got my Freedom statement today, "point us air miles" doesn't count as 5%.
D*a
23 楼
这回答，真简洁
【在 f******g 的大作中提到】
: 测序，
【在 f******g 的大作中提到】
: 测序，
z*i
24 楼
如果能显示detail 想amex卡那样 就会看到17507377000LOYALTY
LOYALTY
1-877-999-6652
3708 AUSTIN CT
FLOWER MOUND
TX
75028-8702
UNITED STATES
查一下这个地址是points.com公司的
【在 h**z 的大作中提到】
: 昨天买的，写的是 point us air miles
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
s*2
25 楼
谢谢回答。还是估摸不出来大概多少细胞数目。
【在 D*a 的大作中提到】
: 一片耳朵洞，消化以后还有一大片，肉眼看不出跟消化前有什么区别。
: 以前用老鼠尾巴，也差不多。
【在 D*a 的大作中提到】
: 一片耳朵洞，消化以后还有一大片，肉眼看不出跟消化前有什么区别。
: 以前用老鼠尾巴，也差不多。
z*i
26 楼
40应该是免的，因为没办法在网上订票。处理费免不了。剩下的就是燃油附加费了。
【在 h**z 的大作中提到】
: 请问定一张中美往返票费用是40（phone) + 50(processing fee) = 90, 还是还有别的
: 费用？
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
f*g
27 楼
简洁，不简单
【在 D*a 的大作中提到】
: 这回答，真简洁
【在 D*a 的大作中提到】
: 这回答，真简洁
D*a
28 楼
我也不知道啊，你大概试试吧，反正不用太多。
如果细胞少，关键是别按protocol上那样加那么多液体，少加点别把dna稀释了。
我的经验是这东西也没有规定必须怎么样
【在 s**2 的大作中提到】
: 谢谢回答。还是估摸不出来大概多少细胞数目。
如果细胞少，关键是别按protocol上那样加那么多液体，少加点别把dna稀释了。
我的经验是这东西也没有规定必须怎么样
【在 s**2 的大作中提到】
: 谢谢回答。还是估摸不出来大概多少细胞数目。
f*g
29 楼
能把你的试剂的配方或者catalog 发给我吗
谢谢
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
谢谢
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
D*a
30 楼
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31538099.html
你的细胞少，少加点mix，减少一点digestion时间，比如2hours
先做做pcr 看看行不行。
pcr不行的话，一般是dna太稀了（mix加太多），或者digestion时间太长了。
用nested pcr测序
现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2,
XNAT2R
没测过序，但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。
【在 f******g 的大作中提到】
: 能把你的试剂的配方或者catalog 发给我吗
: 谢谢
你的细胞少，少加点mix，减少一点digestion时间，比如2hours
先做做pcr 看看行不行。
pcr不行的话，一般是dna太稀了（mix加太多），或者digestion时间太长了。
用nested pcr测序
现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2,
XNAT2R
没测过序，但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。
【在 f******g 的大作中提到】
: 能把你的试剂的配方或者catalog 发给我吗
: 谢谢
f*g
31 楼
谢
,
【在 D*a 的大作中提到】
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31538099.html
: 你的细胞少，少加点mix，减少一点digestion时间，比如2hours
: 先做做pcr 看看行不行。
: pcr不行的话，一般是dna太稀了（mix加太多），或者digestion时间太长了。
: 用nested pcr测序
: 现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2,
: XNAT2R
: 没测过序，但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。
,
【在 D*a 的大作中提到】
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31538099.html
: 你的细胞少，少加点mix，减少一点digestion时间，比如2hours
: 先做做pcr 看看行不行。
: pcr不行的话，一般是dna太稀了（mix加太多），或者digestion时间太长了。
: 用nested pcr测序
: 现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2,
: XNAT2R
: 没测过序，但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。
a*k
32 楼
100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
离心下细胞
加纯水20ul
用20ul枪头快速吹打20次
取2-5ul做PCR，20ul反应体系
PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
离心下细胞
加纯水20ul
用20ul枪头快速吹打20次
取2-5ul做PCR，20ul反应体系
PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
w*r
33 楼
搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
f*g
34 楼
谢谢，请问Exo-SAP什么意思？
率。
【在 a********k 的大作中提到】
: 100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
: 离心下细胞
: 加纯水20ul
: 用20ul枪头快速吹打20次
: 取2-5ul做PCR，20ul反应体系
: PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
: Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
率。
【在 a********k 的大作中提到】
: 100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
: 离心下细胞
: 加纯水20ul
: 用20ul枪头快速吹打20次
: 取2-5ul做PCR，20ul反应体系
: PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
: Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
f*g
35 楼
in vivo筛选吗？
需要1k的条带吗？
【在 w*****r 的大作中提到】
: 搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
: 来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
需要1k的条带吗？
【在 w*****r 的大作中提到】
: 搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
: 来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
s*s
36 楼
pcr purification用的酶。一般pcr好了以后懒得纯化就要测序
的，就要加这个
【在 f******g 的大作中提到】
: 谢谢，请问Exo-SAP什么意思？
:
: 率。
的，就要加这个
【在 f******g 的大作中提到】
: 谢谢，请问Exo-SAP什么意思？
:
: 率。
s*s
37 楼
杂带多的，用nested pcr. 大概就是先用外面一对引物p过，产物
纯化以后再用里面一对p
【在 w*****r 的大作中提到】
: 搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
: 来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
纯化以后再用里面一对p
【在 w*****r 的大作中提到】
: 搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
: 来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
f*g
38 楼
谢谢
【在 s******s 的大作中提到】
: pcr purification用的酶。一般pcr好了以后懒得纯化就要测序
: 的，就要加这个
【在 s******s 的大作中提到】
: pcr purification用的酶。一般pcr好了以后懒得纯化就要测序
: 的，就要加这个
a*a
39 楼
这个好酷！
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。
【在 a********k 的大作中提到】
: 100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
: 离心下细胞
: 加纯水20ul
: 用20ul枪头快速吹打20次
: 取2-5ul做PCR，20ul反应体系
: PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
: Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。
【在 a********k 的大作中提到】
: 100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
: 离心下细胞
: 加纯水20ul
: 用20ul枪头快速吹打20次
: 取2-5ul做PCR，20ul反应体系
: PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
: Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
f*g
40 楼
有好结果，在这说一下，谢谢
【在 a******a 的大作中提到】
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
: 不用跑胶的。
: 我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
: 。做ddPCR的。貌似应该可以把。
:
: 率。
【在 a******a 的大作中提到】
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
: 不用跑胶的。
: 我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
: 。做ddPCR的。貌似应该可以把。
:
: 率。
a*a
41 楼
我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
有没有建议？
另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
什么好的protocol吗？
这个好酷！
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。
【在 f******g 的大作中提到】
: 有好结果，在这说一下，谢谢
；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
有没有建议？
另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
什么好的protocol吗？
这个好酷！
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。
【在 f******g 的大作中提到】
: 有好结果，在这说一下，谢谢
r*g
42 楼
加点水，一煮就行了
直接pcr
直接pcr
a*k
43 楼
我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
基本类似方法
主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
吹打破细胞
20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
然后取4uL产物PCR
【在 a******a 的大作中提到】
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
: 不用跑胶的。
: 我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
: 。做ddPCR的。貌似应该可以把。
:
: 率。
基本类似方法
主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
吹打破细胞
20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
然后取4uL产物PCR
【在 a******a 的大作中提到】
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
: 不用跑胶的。
: 我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
: 。做ddPCR的。貌似应该可以把。
:
: 率。
a*k
44 楼
病理组织更简单，直接加水95度，然后做PCR
如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
【在 a******a 的大作中提到】
: 我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
: ；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
: 我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
: 但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
: 有没有建议？
: 另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
: 什么好的protocol吗？
:
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
【在 a******a 的大作中提到】
: 我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
: ；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
: 我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
: 但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
: 有没有建议？
: 另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
: 什么好的protocol吗？
:
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
a*y
45 楼
Phire direct PCR from Thermo
成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
f*g
46 楼
谢谢。
我这两天正在试quickExtraction solution 呢。
估计下周能看到结果
【在 a******a 的大作中提到】
: 我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
: ；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
: 我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
: 但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
: 有没有建议？
: 另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
: 什么好的protocol吗？
:
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
我这两天正在试quickExtraction solution 呢。
估计下周能看到结果
【在 a******a 的大作中提到】
: 我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
: ；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
: 我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
: 但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
: 有没有建议？
: 另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
: 什么好的protocol吗？
:
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
f*g
47 楼
谢谢
【在 a********k 的大作中提到】
: 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
: 基本类似方法
: 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
: 吹打破细胞
: 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
: 然后取4uL产物PCR
【在 a********k 的大作中提到】
: 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
: 基本类似方法
: 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
: 吹打破细胞
: 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
: 然后取4uL产物PCR
f*g
48 楼
谢谢
【在 a***y 的大作中提到】
: Phire direct PCR from Thermo
: 成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。
【在 a***y 的大作中提到】
: Phire direct PCR from Thermo
: 成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。
D*a
49 楼
那不就是我那个方子
【在 a********k 的大作中提到】
: 病理组织更简单，直接加水95度，然后做PCR
: 如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
: 100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
【在 a********k 的大作中提到】
: 病理组织更简单，直接加水95度，然后做PCR
: 如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
: 100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
a*a
50 楼
谢谢；）收藏了！
【在 a********k 的大作中提到】
: 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
: 基本类似方法
: 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
: 吹打破细胞
: 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
: 然后取4uL产物PCR
【在 a********k 的大作中提到】
: 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
: 基本类似方法
: 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
: 吹打破细胞
: 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
: 然后取4uL产物PCR
a*a
51 楼
像这些直接水解细胞用来做PCR的，样品稳定程度怎么样？caspases应该很容易被激活
分解掉DNA吧？
分解掉DNA吧？
G*a
52 楼
95C人类细胞里的酶基本上都死翘翘了吧？
【在 a******a 的大作中提到】
: 像这些直接水解细胞用来做PCR的，样品稳定程度怎么样？caspases应该很容易被激活
: 分解掉DNA吧？
【在 a******a 的大作中提到】
: 像这些直接水解细胞用来做PCR的，样品稳定程度怎么样？caspases应该很容易被激活
: 分解掉DNA吧？
a*k
53 楼
记得大多数步骤冰上操作。。。
【在 a******a 的大作中提到】
: 谢谢；）收藏了！
【在 a******a 的大作中提到】
: 谢谢；）收藏了！
d*i
54 楼
你好牛啊！这种方法稳定性如何？
96well的细胞是不是就太多了，一直想怎么样直接从96 well取细胞做realtime。现在
都是用24 well抽屉RNA，然后再做realtime。
【在 a********k 的大作中提到】
: 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
: 基本类似方法
: 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
: 吹打破细胞
: 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
: 然后取4uL产物PCR
a*a
55 楼
我做了一些，水解细胞，溶液直接加入pcr系统去。结果发现出现的都是假阳性信号。
当然我是读取taqman荧光信号来衡量pcr结果的，不是跑胶。
解释是，nucleases直接切掉probe上的fluorophores，所以出现的荧光信号都是假阳性。
那么对我来说，我这个系统（依靠读取荧光信号来判断pcr结果的）就最好先加tris
buffer和proteanse K来除掉nucleases，再水煮一下样品灭火protease K或者其他的酶
。之后加入PCR系统。
看看怎么样，这个方案可好？
【在 a********k 的大作中提到】
: 病理组织更简单，直接加水95度，然后做PCR
: 如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
: 100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
当然我是读取taqman荧光信号来衡量pcr结果的，不是跑胶。
解释是，nucleases直接切掉probe上的fluorophores，所以出现的荧光信号都是假阳性。
那么对我来说，我这个系统（依靠读取荧光信号来判断pcr结果的）就最好先加tris
buffer和proteanse K来除掉nucleases，再水煮一下样品灭火protease K或者其他的酶
。之后加入PCR系统。
看看怎么样，这个方案可好？
【在 a********k 的大作中提到】
: 病理组织更简单，直接加水95度，然后做PCR
: 如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
: 100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
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