KO小鼠得不到纯合子，求解！ - 未名空间MITBBS历史存档

KO小鼠得不到纯合子，求解！# Biology - 生物学

m*82014-04-20 07:04

1 楼

各位大侠好，我去年从KOMP购买了某个基因的targeting vector，让我们的transgenic
core做了knock out小鼠，得到heterozygous小鼠后，鉴定了半年，超过200多个pups
，仍没有纯合子小鼠。该基因是睾丸特异表达的，敲除理论上是不会致死的。更奇怪的
是后代基因型比例也不对，完全不符合孟德尔遗传定律，heterozygous的后代偏多。此
外，我还从体内取了一细胞胚胎，体外发育到囊胚，做了囊胚的genotyping，也得不到
-/-，囊胚之前的胚胎发育很正常。我用了多套引物进行过genetyping，扩出来的片段
，包括野生型和杂合子片段都经过测序验证。我很困惑，请给位大侠多多给小弟提出宝
贵意见，不胜感激。
ps：附件中是我鉴定的电泳图谱，两条带说明是杂合子，只有下面的条带说明是
野生型，只有上面的条带说明是纯合子。最后一孔为阴性对照。

T*u2014-04-20 07:04

2 楼

为什么-/- lethal不可能呢？
embrynonic lethal?
虽然是睾丸特异性表达，还有些基因在发育过程中会瞬时表达，发挥作用就silence掉
了。
你最终看到的是组织特异性表达。
还是try Loxp吧。

transgenic
pups

【在 m*******8 的大作中提到】

: 各位大侠好，我去年从KOMP购买了某个基因的targeting vector，让我们的transgenic
: core做了knock out小鼠，得到heterozygous小鼠后，鉴定了半年，超过200多个pups
: ，仍没有纯合子小鼠。该基因是睾丸特异表达的，敲除理论上是不会致死的。更奇怪的
: 是后代基因型比例也不对，完全不符合孟德尔遗传定律，heterozygous的后代偏多。此
: 外，我还从体内取了一细胞胚胎，体外发育到囊胚，做了囊胚的genotyping，也得不到
: -/-，囊胚之前的胚胎发育很正常。我用了多套引物进行过genetyping，扩出来的片段
: ，包括野生型和杂合子片段都经过测序验证。我很困惑，请给位大侠多多给小弟提出宝
: 贵意见，不胜感激。
: ps：附件中是我鉴定的电泳图谱，两条带说明是杂合子，只有下面的条带说明是
: 野生型，只有上面的条带说明是纯合子。最后一孔为阴性对照。

m*52014-04-20 07:04

3 楼

如果是Komp的targeting vector,应该是KO first吧
这好办，买个Flipase鼠把它变成conditional knock out先

m*82014-04-20 07:04

4 楼

已经检测早期胚胎发育了，看起来没有问题。

【在 T****u 的大作中提到】

: 为什么-/- lethal不可能呢？
: embrynonic lethal?
: 虽然是睾丸特异性表达，还有些基因在发育过程中会瞬时表达，发挥作用就silence掉
: 了。
: 你最终看到的是组织特异性表达。
: 还是try Loxp吧。
:
: transgenic
: pups

r*g2014-04-20 07:04

5 楼

你cross het 和 het 时，把 male的精子pcr一下，看看是不是根本木有ko haplotype！
如果是睾丸特异的，分析一下减速分裂！ loxp是个好主意！

m*52014-04-20 07:04

6 楼

还有，komp的载体上有lacz reporter, 楼主看看表达pattern到底是啥样的，睾丸特异
表达的基因其实也有可能是pluripotent基因

【在 m*******8 的大作中提到】

: 各位大侠好，我去年从KOMP购买了某个基因的targeting vector，让我们的transgenic
: core做了knock out小鼠，得到heterozygous小鼠后，鉴定了半年，超过200多个pups
: ，仍没有纯合子小鼠。该基因是睾丸特异表达的，敲除理论上是不会致死的。更奇怪的
: 是后代基因型比例也不对，完全不符合孟德尔遗传定律，heterozygous的后代偏多。此
: 外，我还从体内取了一细胞胚胎，体外发育到囊胚，做了囊胚的genotyping，也得不到
: -/-，囊胚之前的胚胎发育很正常。我用了多套引物进行过genetyping，扩出来的片段
: ，包括野生型和杂合子片段都经过测序验证。我很困惑，请给位大侠多多给小弟提出宝
: 贵意见，不胜感激。
: ps：附件中是我鉴定的电泳图谱，两条带说明是杂合子，只有下面的条带说明是
: 野生型，只有上面的条带说明是纯合子。最后一孔为阴性对照。

s*y2014-04-20 07:04

7 楼

Heterogygous 是不是正好是WT 的两倍？
如果是的话，说明你的纯化体可能是早期胚胎致死。

transgenic
pups

【在 m*******8 的大作中提到】

: 各位大侠好，我去年从KOMP购买了某个基因的targeting vector，让我们的transgenic
: core做了knock out小鼠，得到heterozygous小鼠后，鉴定了半年，超过200多个pups
: ，仍没有纯合子小鼠。该基因是睾丸特异表达的，敲除理论上是不会致死的。更奇怪的
: 是后代基因型比例也不对，完全不符合孟德尔遗传定律，heterozygous的后代偏多。此
: 外，我还从体内取了一细胞胚胎，体外发育到囊胚，做了囊胚的genotyping，也得不到
: -/-，囊胚之前的胚胎发育很正常。我用了多套引物进行过genetyping，扩出来的片段
: ，包括野生型和杂合子片段都经过测序验证。我很困惑，请给位大侠多多给小弟提出宝
: 贵意见，不胜感激。
: ps：附件中是我鉴定的电泳图谱，两条带说明是杂合子，只有下面的条带说明是
: 野生型，只有上面的条带说明是纯合子。最后一孔为阴性对照。

c*n2014-04-20 07:04

8 楼

先Southern 或 PCR 鉴定一下是否是KO。
俺上次买的老鼠也死活得不到纯合子，最后发现是TRANSGENIC, 也不知道片断插到那个
染色体上了，费了无数时间及精力，最后全杀之。

m*82014-04-20 07:04

9 楼

多谢！

【在 c*******n 的大作中提到】

: 先Southern 或 PCR 鉴定一下是否是KO。
: 俺上次买的老鼠也死活得不到纯合子，最后发现是TRANSGENIC, 也不知道片断插到那个
: 染色体上了，费了无数时间及精力，最后全杀之。

s*92014-04-20 07:04

10 楼

我以后绝对不会再相信KOMP。我们也买了一个老鼠ES cell，也是拿不到KO，全是hete
和WT。最后发现它给的ES cell不是单克隆，混了很多的clone，转进去的那个ES clone
位点不对。
整个过程耽误了一年多。

transgenic
pups

【在 m*******8 的大作中提到】

: 各位大侠好，我去年从KOMP购买了某个基因的targeting vector，让我们的transgenic
: core做了knock out小鼠，得到heterozygous小鼠后，鉴定了半年，超过200多个pups
: ，仍没有纯合子小鼠。该基因是睾丸特异表达的，敲除理论上是不会致死的。更奇怪的
: 是后代基因型比例也不对，完全不符合孟德尔遗传定律，heterozygous的后代偏多。此
: 外，我还从体内取了一细胞胚胎，体外发育到囊胚，做了囊胚的genotyping，也得不到
: -/-，囊胚之前的胚胎发育很正常。我用了多套引物进行过genetyping，扩出来的片段
: ，包括野生型和杂合子片段都经过测序验证。我很困惑，请给位大侠多多给小弟提出宝
: 贵意见，不胜感激。
: ps：附件中是我鉴定的电泳图谱，两条带说明是杂合子，只有下面的条带说明是
: 野生型，只有上面的条带说明是纯合子。最后一孔为阴性对照。

t*k2014-04-20 07:04

11 楼

那个lacZ可能很弱，不一定能染出来

【在 m******5 的大作中提到】

: 还有，komp的载体上有lacz reporter, 楼主看看表达pattern到底是啥样的，睾丸特异
: 表达的基因其实也有可能是pluripotent基因

s*n2014-04-20 07:04

12 楼

KOMP的老鼠就是这么坑爹，订购过五种缺陷鼠，没有一种育出来的，育种中根本就不符
合孟德尔定律。浪费了俺一年时间，满满的都是恨！

transgenic
pups

【在 m*******8 的大作中提到】

: 各位大侠好，我去年从KOMP购买了某个基因的targeting vector，让我们的transgenic
: core做了knock out小鼠，得到heterozygous小鼠后，鉴定了半年，超过200多个pups
: ，仍没有纯合子小鼠。该基因是睾丸特异表达的，敲除理论上是不会致死的。更奇怪的
: 是后代基因型比例也不对，完全不符合孟德尔遗传定律，heterozygous的后代偏多。此
: 外，我还从体内取了一细胞胚胎，体外发育到囊胚，做了囊胚的genotyping，也得不到
: -/-，囊胚之前的胚胎发育很正常。我用了多套引物进行过genetyping，扩出来的片段
: ，包括野生型和杂合子片段都经过测序验证。我很困惑，请给位大侠多多给小弟提出宝
: 贵意见，不胜感激。
: ps：附件中是我鉴定的电泳图谱，两条带说明是杂合子，只有下面的条带说明是
: 野生型，只有上面的条带说明是纯合子。最后一孔为阴性对照。

g*52014-04-20 07:04

13 楼

KOMP...God bless my mouse!

l*e2014-04-20 07:04

14 楼

说句得罪人的话，这是研究者自己的问题吧。
Komp的ES cell
1)不保证可以传germline
2)很多没有southern confirmed targeting
所以拿到ES clone后马上就应该Expand，Karyotyping, Southern

hete
clone

【在 s****9 的大作中提到】

: 我以后绝对不会再相信KOMP。我们也买了一个老鼠ES cell，也是拿不到KO，全是hete
: 和WT。最后发现它给的ES cell不是单克隆，混了很多的clone，转进去的那个ES clone
: 位点不对。
: 整个过程耽误了一年多。
:
: transgenic
: pups

F*p2014-04-20 07:04

15 楼

+1

【在 c*******n 的大作中提到】

: 先Southern 或 PCR 鉴定一下是否是KO。
: 俺上次买的老鼠也死活得不到纯合子，最后发现是TRANSGENIC, 也不知道片断插到那个
: 染色体上了，费了无数时间及精力，最后全杀之。

D*a2014-04-20 07:04

16 楼

re 楼主提供一下数据吧，偏多是多多少？

【在 s******y 的大作中提到】

: Heterogygous 是不是正好是WT 的两倍？
: 如果是的话，说明你的纯化体可能是早期胚胎致死。
:
: transgenic
: pups

m*82014-04-20 07:04

17 楼

我们买的是targeting vector，找我们所的core做的后面的工作，你说的东西我们都做
了。

【在 l********e 的大作中提到】

: 说句得罪人的话，这是研究者自己的问题吧。
: Komp的ES cell
: 1)不保证可以传germline
: 2)很多没有southern confirmed targeting
: 所以拿到ES clone后马上就应该Expand，Karyotyping, Southern
:
: hete
: clone

m*82014-04-20 07:04

18 楼

Het:WT 大于 4:1

【在 D*a 的大作中提到】

: re 楼主提供一下数据吧，偏多是多多少？

D*a2014-04-20 07:04

19 楼

这是het x het？
那het x wt呢？

【在 m*******8 的大作中提到】

: Het:WT 大于 4:1

m*82014-04-20 07:04

20 楼

het X het
你有什么想法？

【在 D*a 的大作中提到】

: 这是het x het？
: 那het x wt呢？