c*e
2 楼
有一个allele,我们做了TALEN,因为没有合适的限制性酶,用了T7, T7 indicate 可
能有“indel",我的问题是,如何确认这个”indel",不知直接deep sequence之类可
以不,不太想做PCR TA clone,然后做regular sequence。谢谢。
能有“indel",我的问题是,如何确认这个”indel",不知直接deep sequence之类可
以不,不太想做PCR TA clone,然后做regular sequence。谢谢。
l*y
3 楼
可以
不知道怎么搞的话george church有个protocol
http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/early/2014/06/
tics.btu427.full.pdf
【在 c*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 有一个allele,我们做了TALEN,因为没有合适的限制性酶,用了T7, T7 indicate 可
: 能有“indel",我的问题是,如何确认这个”indel",不知直接deep sequence之类可
: 以不,不太想做PCR TA clone,然后做regular sequence。谢谢。
不知道怎么搞的话george church有个protocol
http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/early/2014/06/
tics.btu427.full.pdf
【在 c*******e 的大作中提到】
![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 有一个allele,我们做了TALEN,因为没有合适的限制性酶,用了T7, T7 indicate 可
: 能有“indel",我的问题是,如何确认这个”indel",不知直接deep sequence之类可
: 以不,不太想做PCR TA clone,然后做regular sequence。谢谢。
j*i
4 楼
t7是很可靠的。不放心的话可以把pcr条带做sanger测序,然后用tide分析. http://tide.nki.nl。tide是用来分析CRISPR的,不过调整一下参数也能看出有没有indel. 直接上deep sequencing的话, 我只能说有钱,任性!
h*n
5 楼
同意,TALEN完全没必要用deep sequencing的方法确认indel,就普通的PCR条带直接
sanger测序然后分析足够了
序列分析用MutationSurveyor也可以看indel
deep sequencing不止是有钱任性,看indel还不如普通的sanger测序准确,何苦
【在 j******i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: t7是很可靠的。不放心的话可以把pcr条带做sanger测序,然后用tide分析. http://tide.nki.nl。tide是用来分析CRISPR的,不过调整一下参数也能看出有没有indel. 直接上deep sequencing的话, 我只能说有钱,任性!
sanger测序然后分析足够了
序列分析用MutationSurveyor也可以看indel
deep sequencing不止是有钱任性,看indel还不如普通的sanger测序准确,何苦
【在 j******i 的大作中提到】
![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: t7是很可靠的。不放心的话可以把pcr条带做sanger测序,然后用tide分析. http://tide.nki.nl。tide是用来分析CRISPR的,不过调整一下参数也能看出有没有indel. 直接上deep sequencing的话, 我只能说有钱,任性!
c*e
6 楼
先谢谢大家,我去研究研究你们的建议。
我的问题是PCR是mixture,估计也就<10%的 indel,所以要灵敏度高些的方法。
我现在想跑一个page gel,因为indel估计要induce size difference,这个要是行,
比较简单,直接对比WT。想过SSCP,但要麻烦些。
【在 h****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 同意,TALEN完全没必要用deep sequencing的方法确认indel,就普通的PCR条带直接
: sanger测序然后分析足够了
: 序列分析用MutationSurveyor也可以看indel
: deep sequencing不止是有钱任性,看indel还不如普通的sanger测序准确,何苦
我的问题是PCR是mixture,估计也就<10%的 indel,所以要灵敏度高些的方法。
我现在想跑一个page gel,因为indel估计要induce size difference,这个要是行,
比较简单,直接对比WT。想过SSCP,但要麻烦些。
【在 h****n 的大作中提到】
![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 同意,TALEN完全没必要用deep sequencing的方法确认indel,就普通的PCR条带直接
: sanger测序然后分析足够了
: 序列分析用MutationSurveyor也可以看indel
: deep sequencing不止是有钱任性,看indel还不如普通的sanger测序准确,何苦
s*r
8 楼
deep sequencing适合做量大的,几个sample的做划不来,多到几十上百个sample的话
比其他方法都便宜
比其他方法都便宜
h*n
11 楼
啊,你是说你要看注射TALEN以后的第一代吗?那个确实没办法直接PCR测序,本来就是
各种indel的混合。我说的是outcross以后拿到单一allele以后的办法。
其实PCR以后TA cloning以后再sanger测序不难啊,也就顶多一个礼拜的工作量。
用HRMA的办法就可以不用测序了,省事很多。反正第一代本来就是mixture,无所
谓立刻知道到底有哪些indel。outcross以后拿到稳定单一hets再测序确定好了
你们实验室如果有能做HRMA的仪器也行,不差钱就买一台,不然到别的实验室蹭机子用
也成啊lol
【在 c*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 先谢谢大家,我去研究研究你们的建议。
: 我的问题是PCR是mixture,估计也就<10%的 indel,所以要灵敏度高些的方法。
: 我现在想跑一个page gel,因为indel估计要induce size difference,这个要是行,
: 比较简单,直接对比WT。想过SSCP,但要麻烦些。
各种indel的混合。我说的是outcross以后拿到单一allele以后的办法。
其实PCR以后TA cloning以后再sanger测序不难啊,也就顶多一个礼拜的工作量。
用HRMA的办法就可以不用测序了,省事很多。反正第一代本来就是mixture,无所
谓立刻知道到底有哪些indel。outcross以后拿到稳定单一hets再测序确定好了
你们实验室如果有能做HRMA的仪器也行,不差钱就买一台,不然到别的实验室蹭机子用
也成啊lol
【在 c*******e 的大作中提到】
![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 先谢谢大家,我去研究研究你们的建议。
: 我的问题是PCR是mixture,估计也就<10%的 indel,所以要灵敏度高些的方法。
: 我现在想跑一个page gel,因为indel估计要induce size difference,这个要是行,
: 比较简单,直接对比WT。想过SSCP,但要麻烦些。
c*e
12 楼
谢谢你,
这个HRMA是high resolution melting analysis吗?
【在 h****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 啊,你是说你要看注射TALEN以后的第一代吗?那个确实没办法直接PCR测序,本来就是
: 各种indel的混合。我说的是outcross以后拿到单一allele以后的办法。
: 其实PCR以后TA cloning以后再sanger测序不难啊,也就顶多一个礼拜的工作量。
: 用HRMA的办法就可以不用测序了,省事很多。反正第一代本来就是mixture,无所
: 谓立刻知道到底有哪些indel。outcross以后拿到稳定单一hets再测序确定好了
: 你们实验室如果有能做HRMA的仪器也行,不差钱就买一台,不然到别的实验室蹭机子用
: 也成啊lol
这个HRMA是high resolution melting analysis吗?
【在 h****n 的大作中提到】
![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 啊,你是说你要看注射TALEN以后的第一代吗?那个确实没办法直接PCR测序,本来就是
: 各种indel的混合。我说的是outcross以后拿到单一allele以后的办法。
: 其实PCR以后TA cloning以后再sanger测序不难啊,也就顶多一个礼拜的工作量。
: 用HRMA的办法就可以不用测序了,省事很多。反正第一代本来就是mixture,无所
: 谓立刻知道到底有哪些indel。outcross以后拿到稳定单一hets再测序确定好了
: 你们实验室如果有能做HRMA的仪器也行,不差钱就买一台,不然到别的实验室蹭机子用
: 也成啊lol
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