m*D
2 楼
有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
selection marker，基本上指望不大。
生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
花了。
谢谢上次给我出主意的人。我现在也算CRISPR的“专家”了。：）。
本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
selection marker，基本上指望不大。
生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
花了。
谢谢上次给我出主意的人。我现在也算CRISPR的“专家”了。：）。
k*a
3 楼
程序有时限，有时很难用上
h*l
4 楼
请问是哪篇bio techniques? selection marker 有时候不好引入啊。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
: 本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
: 友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
: 作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
: replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
: replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
: 刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
: selection marker，基本上指望不大。
: 生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
: 花了。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
: 本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
: 友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
: 作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
: replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
: replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
: 刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
: selection marker，基本上指望不大。
: 生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
: 花了。
x*e
5 楼
想起我一朋友用CRISPR在果蝇里做SNP的点突变。很快就做出来了，突变率还特别高，
大家都兴奋得不得了。结果后来发现是cas9的line里面带了这个SNP。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
: 本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
: 友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
: 作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
: replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
: replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
: 刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
: selection marker，基本上指望不大。
: 生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
: 花了。
大家都兴奋得不得了。结果后来发现是cas9的line里面带了这个SNP。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
: 本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
: 友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
: 作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
: replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
: replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
: 刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
: selection marker，基本上指望不大。
: 生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
: 花了。
m*D
6 楼
仔细看了一下，是2014的--precise gene deletion and replacement using the
CRISPR/Ca9 system in human cells。
【在 h***l 的大作中提到】
: 请问是哪篇bio techniques? selection marker 有时候不好引入啊。
CRISPR/Ca9 system in human cells。
【在 h***l 的大作中提到】
: 请问是哪篇bio techniques? selection marker 有时候不好引入啊。
m*D
7 楼
嘿嘿，你的bio论坛还没建起来呀？：）。你的能量真让我佩服，这么多论坛主题度有
你的身影。
反正是不容易。我这是给实验室的学生打基础的。游乐这些mutants，他们可以作自己
的research project。而我还得打酱油。
【在 x********e 的大作中提到】
: 想起我一朋友用CRISPR在果蝇里做SNP的点突变。很快就做出来了，突变率还特别高，
: 大家都兴奋得不得了。结果后来发现是cas9的line里面带了这个SNP。
你的身影。
反正是不容易。我这是给实验室的学生打基础的。游乐这些mutants，他们可以作自己
的research project。而我还得打酱油。
【在 x********e 的大作中提到】
: 想起我一朋友用CRISPR在果蝇里做SNP的点突变。很快就做出来了，突变率还特别高，
: 大家都兴奋得不得了。结果后来发现是cas9的line里面带了这个SNP。
x*e
8 楼
你用了repair template吗
【在 m*********D 的大作中提到】
: 嘿嘿，你的bio论坛还没建起来呀？：）。你的能量真让我佩服，这么多论坛主题度有
: 你的身影。
: 反正是不容易。我这是给实验室的学生打基础的。游乐这些mutants，他们可以作自己
: 的research project。而我还得打酱油。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 嘿嘿，你的bio论坛还没建起来呀？：）。你的能量真让我佩服，这么多论坛主题度有
: 你的身影。
: 反正是不容易。我这是给实验室的学生打基础的。游乐这些mutants，他们可以作自己
: 的research project。而我还得打酱油。
r*g
9 楼
楼主，问个naive question
你做point mutation 用什么办法select呢？
用的endonuclease来select吗？
成功率有多少？
你做point mutation 用什么办法select呢？
用的endonuclease来select吗？
成功率有多少？
m*D
10 楼
当然。
【在 x********e 的大作中提到】
: 你用了repair template吗
【在 x********e 的大作中提到】
: 你用了repair template吗
m*D
11 楼
我能想出来的就是IRES接G418一类的。这就搞掉/改变了3-UTR一类的。不知道一个G418
的expression casseette能不能插到intron里。
Biotech的文章用的是GFP fusion.我用的是mutant的特性来select。
【在 r******g 的大作中提到】
: 楼主，问个naive question
: 你做point mutation 用什么办法select呢？
: 用的endonuclease来select吗？
: 成功率有多少？
的expression casseette能不能插到intron里。
Biotech的文章用的是GFP fusion.我用的是mutant的特性来select。
【在 r******g 的大作中提到】
: 楼主，问个naive question
: 你做point mutation 用什么办法select呢？
: 用的endonuclease来select吗？
: 成功率有多少？
Z*g
12 楼
最近不是出来两篇Nat Biotech的文章吗，说是用小分子抑制NHEJ可明显增强HDR效率。
不知效果如何。
不知效果如何。
h*a
13 楼
我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的genomic DNA吗？怎样快速的做从单克隆到
PCR鉴定这一步？
4. 你所说的transfected cells的单copy 的replacement是千分之一，那你在有
selection marker的情况下，单克隆能拿到heterozygous point mution的效率是多高
？ Homozygous的效率又是多高呢？挑多少克隆最后能拿到homozygous?
对crispr做mutation实在是太新手了，希望你能帮助解答疑问，不胜感激啊！！！
1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的genomic DNA吗？怎样快速的做从单克隆到
PCR鉴定这一步？
4. 你所说的transfected cells的单copy 的replacement是千分之一，那你在有
selection marker的情况下，单克隆能拿到heterozygous point mution的效率是多高
？ Homozygous的效率又是多高呢？挑多少克隆最后能拿到homozygous?
对crispr做mutation实在是太新手了，希望你能帮助解答疑问，不胜感激啊！！！
m*D
14 楼
1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
**是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的genomic DNA吗？怎样快速的做从单克隆到
PCR鉴定这一步？
**基本差不多。我用12-well plate,1 well来体genomic DNA.
4. 你所说的transfected cells的单copy 的replacement是千分之一，那你在有
selection marker的情况下，单克隆能拿到heterozygous point mution的效率是多高
？ Homozygous的效率又是多高呢？挑多少克隆最后能拿到homozygous?
对crispr做mutation实在是太新手了，希望你能帮助解答疑问，不胜感激啊！！！
**我原文说了，没有selection，heterozygous point mutation的效率在千分之一以下
。homozygous更低。有筛选，效率就高多了。
吗？
【在 h****a 的大作中提到】
: 我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
: 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
: puro+)
: Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
: 你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
: Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
: 时候好像也不方便在donor上引入selection marker
: 2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
: 3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
: 在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
**是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的genomic DNA吗？怎样快速的做从单克隆到
PCR鉴定这一步？
**基本差不多。我用12-well plate,1 well来体genomic DNA.
4. 你所说的transfected cells的单copy 的replacement是千分之一，那你在有
selection marker的情况下，单克隆能拿到heterozygous point mution的效率是多高
？ Homozygous的效率又是多高呢？挑多少克隆最后能拿到homozygous?
对crispr做mutation实在是太新手了，希望你能帮助解答疑问，不胜感激啊！！！
**我原文说了，没有selection，heterozygous point mutation的效率在千分之一以下
。homozygous更低。有筛选，效率就高多了。
吗？
【在 h****a 的大作中提到】
: 我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
: 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
: puro+)
: Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
: 你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
: Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
: 时候好像也不方便在donor上引入selection marker
: 2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
: 3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
: 在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
m*D
15 楼
还没看到呢。谢谢提醒。
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 最近不是出来两篇Nat Biotech的文章吗，说是用小分子抑制NHEJ可明显增强HDR效率。
: 不知效果如何。
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 最近不是出来两篇Nat Biotech的文章吗，说是用小分子抑制NHEJ可明显增强HDR效率。
: 不知效果如何。
h*a
16 楼
太谢谢你的回复了，明白了很多问题，谢谢！
j*i
17 楼
那篇Nature biotech SCR7有谁可以重复出来吗 我用ZFN测试效果不大啊
L*e
18 楼
同问～
这个SCR7的原始cell paper都有问题，目前也没有人能重复出来。
至于在CRISPR/CAS9效率上，有人尝试成功过吗？
【在 j******i 的大作中提到】
: 那篇Nature biotech SCR7有谁可以重复出来吗 我用ZFN测试效果不大啊
这个SCR7的原始cell paper都有问题，目前也没有人能重复出来。
至于在CRISPR/CAS9效率上，有人尝试成功过吗？
【在 j******i 的大作中提到】
: 那篇Nature biotech SCR7有谁可以重复出来吗 我用ZFN测试效果不大啊
d*s
19 楼
点突变测序验证了吗？我正开始作。可以建议doner上怎么引入selection marker吗?
谢谢!
吗？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
: puro+)
: Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
: 你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
: Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
: 时候好像也不方便在donor上引入selection marker
: **我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
: 以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
: 生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
: 2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
谢谢!
吗？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
: puro+)
: Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
: 你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
: Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
: 时候好像也不方便在donor上引入selection marker
: **我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
: 以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
: 生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
: 2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
d*3
20 楼
路过，效率这么低？
嘀咕
嘀咕
m*D
21 楼
先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
吗？
**是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
还有约25%在酶切上看不出来，也没有sequencing它们，所以不知具体原因。Double-或
single-replacement mutant里面挑出来一部分作了sequence,证实了mutation.
希望我的经验多大家有帮助。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 点突变测序验证了吗？我正开始作。可以建议doner上怎么引入selection marker吗?
: 谢谢!
:
: 吗？
”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
吗？
**是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
还有约25%在酶切上看不出来，也没有sequencing它们，所以不知具体原因。Double-或
single-replacement mutant里面挑出来一部分作了sequence,证实了mutation.
希望我的经验多大家有帮助。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 点突变测序验证了吗？我正开始作。可以建议doner上怎么引入selection marker吗?
: 谢谢!
:
: 吗？
d*s
22 楼
非常感谢! 你用了一个还是两个gRNA. Biotechnology paper用了两个.
replacement,
【在 m*********D 的大作中提到】
: 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
: ”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
: 吗？
: **是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
: 我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
: 位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
: transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
: 细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
: mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
: 约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
replacement,
【在 m*********D 的大作中提到】
: 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
: ”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
: 吗？
: **是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
: 我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
: 位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
: transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
: 细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
: mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
: 约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
m*D
23 楼
我也用了两个。当时的想法很简单：1。不准备测guide RNA的效率，两个里有一个work
就可以了；2。两个guide RNA可以删掉一段很重要的序列，没有这个，细胞无论有没有
HDR,都不能生存，有利我拿到mutant.当然，我那个phenotype筛选可能是最有用的。
我不在乎off-target.我当时觉得，我要能拿到多个mutant,和stable cell line一样，
就五所谓了。我可以比较不同克隆来消除off-target的影响。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 非常感谢! 你用了一个还是两个gRNA. Biotechnology paper用了两个.
:
: replacement,
就可以了；2。两个guide RNA可以删掉一段很重要的序列，没有这个，细胞无论有没有
HDR,都不能生存，有利我拿到mutant.当然，我那个phenotype筛选可能是最有用的。
我不在乎off-target.我当时觉得，我要能拿到多个mutant,和stable cell line一样，
就五所谓了。我可以比较不同克隆来消除off-target的影响。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 非常感谢! 你用了一个还是两个gRNA. Biotechnology paper用了两个.
:
: replacement,
d*s
24 楼
这么说，你设计两个px459载体(每个有一个gRNA)和doner一起转到细胞裏。是吗？
这个贴会让很多人受益。
work
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我也用了两个。当时的想法很简单：1。不准备测guide RNA的效率，两个里有一个work
: 就可以了；2。两个guide RNA可以删掉一段很重要的序列，没有这个，细胞无论有没有
: HDR,都不能生存，有利我拿到mutant.当然，我那个phenotype筛选可能是最有用的。
: 我不在乎off-target.我当时觉得，我要能拿到多个mutant,和stable cell line一样，
: 就五所谓了。我可以比较不同克隆来消除off-target的影响。
这个贴会让很多人受益。
work
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我也用了两个。当时的想法很简单：1。不准备测guide RNA的效率，两个里有一个work
: 就可以了；2。两个guide RNA可以删掉一段很重要的序列，没有这个，细胞无论有没有
: HDR,都不能生存，有利我拿到mutant.当然，我那个phenotype筛选可能是最有用的。
: 我不在乎off-target.我当时觉得，我要能拿到多个mutant,和stable cell line一样，
: 就五所谓了。我可以比较不同克隆来消除off-target的影响。
m*D
25 楼
是。从single-replacement的“Wildtype"copy情况看，两个guide sequences都起了作
用。之所以加引号，是因为没有真正的wildtype，两个dsb上独有indels.
本意是让想用CRISPR作point-mutation的注意risk,没有筛选的情况下概率太小了一些
。我自己的概率是1 out of 1000左右呢。我看了biotechnique的那篇文章，也差不多
。所以，提醒一下。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 这么说，你设计两个px459载体(每个有一个gRNA)和doner一起转到细胞裏。是吗？
: 这个贴会让很多人受益。
:
: work
用。之所以加引号，是因为没有真正的wildtype，两个dsb上独有indels.
本意是让想用CRISPR作point-mutation的注意risk,没有筛选的情况下概率太小了一些
。我自己的概率是1 out of 1000左右呢。我看了biotechnique的那篇文章，也差不多
。所以，提醒一下。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 这么说，你设计两个px459载体(每个有一个gRNA)和doner一起转到细胞裏。是吗？
: 这个贴会让很多人受益。
:
: work
p*b
26 楼
您好， 请问您PCR之后是直接酶切鉴定还是说把PCR产物纯化之后再酶切？ 我也打算做
类似的实验， 考虑到要鉴定的克隆数量比较多， 如果需要纯化pcr产物再酶切的话，
工作量就大了很多， 谢谢
类似的实验， 考虑到要鉴定的克隆数量比较多， 如果需要纯化pcr产物再酶切的话，
工作量就大了很多， 谢谢
m*D
27 楼
粗筛的时候，不用纯化。后面sequencing，我倒是从gel纯化酶切或没有切的条带。没
有酶切的条带（non-HDR)往往不纯，我有两个酶切点，倒是帮了点忙。
我粗筛是用genomic DNA--PCR。细筛和sequencing，我用得mRNA/cDNA--PCR.
，
【在 p******b 的大作中提到】
: 您好， 请问您PCR之后是直接酶切鉴定还是说把PCR产物纯化之后再酶切？ 我也打算做
: 类似的实验， 考虑到要鉴定的克隆数量比较多， 如果需要纯化pcr产物再酶切的话，
: 工作量就大了很多， 谢谢
有酶切的条带（non-HDR)往往不纯，我有两个酶切点，倒是帮了点忙。
我粗筛是用genomic DNA--PCR。细筛和sequencing，我用得mRNA/cDNA--PCR.
，
【在 p******b 的大作中提到】
: 您好， 请问您PCR之后是直接酶切鉴定还是说把PCR产物纯化之后再酶切？ 我也打算做
: 类似的实验， 考虑到要鉴定的克隆数量比较多， 如果需要纯化pcr产物再酶切的话，
: 工作量就大了很多， 谢谢
p*b
28 楼
谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？
p*b
29 楼
谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？
p*b
30 楼
谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？
m*D
31 楼
我用Q5作PCR,NEB的Cutsmart buffer作我的酶切。5 ulPCR到20 ul digestion。你要担
心这个，可以少用点PCR，2 ul应该可以。现在的gel拍片都可以enhance，所以，DNA量
少一点不会是问题。
【在 p******b 的大作中提到】
: 谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？
心这个，可以少用点PCR，2 ul应该可以。现在的gel拍片都可以enhance，所以，DNA量
少一点不会是问题。
【在 p******b 的大作中提到】
: 谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？
p*b
32 楼
好的， 谢谢老大！
o*4
33 楼
我的donar上没有筛选标志，也想用crispr跟ssODN做knockin，按照你说的效率极低，
heterozygous的效率都只有千分之一，那homozygous是不是没戏了？
要是你会挑多少克隆试试呢？
非常感谢。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我用Q5作PCR,NEB的Cutsmart buffer作我的酶切。5 ulPCR到20 ul digestion。你要担
: 心这个，可以少用点PCR，2 ul应该可以。现在的gel拍片都可以enhance，所以，DNA量
: 少一点不会是问题。
heterozygous的效率都只有千分之一，那homozygous是不是没戏了？
要是你会挑多少克隆试试呢？
非常感谢。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我用Q5作PCR,NEB的Cutsmart buffer作我的酶切。5 ulPCR到20 ul digestion。你要担
: 心这个，可以少用点PCR，2 ul应该可以。现在的gel拍片都可以enhance，所以，DNA量
: 少一点不会是问题。
o*4
34 楼
这个效率好低啊，
千分之一不到，看样子难道要挑1000个以上的克隆吗？
replacement,
【在 m*********D 的大作中提到】
: 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
: ”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
: 吗？
: **是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
: 我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
: 位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
: transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
: 细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
: mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
: 约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
千分之一不到，看样子难道要挑1000个以上的克隆吗？
replacement,
【在 m*********D 的大作中提到】
: 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
: ”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
: 吗？
: **是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
: 我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
: 位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
: transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
: 细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
: mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
: 约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
m*D
35 楼
你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
你的基因后面。
按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
【在 o**4 的大作中提到】
: 这个效率好低啊，
: 千分之一不到，看样子难道要挑1000个以上的克隆吗？
:
: replacement,
不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
你的基因后面。
按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
【在 o**4 的大作中提到】
: 这个效率好低啊，
: 千分之一不到，看样子难道要挑1000个以上的克隆吗？
:
: replacement,
o*4
36 楼
这个想法非常好，非常感谢，
我好好想想吧，感觉这个方法可行。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
我好好想想吧，感觉这个方法可行。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
o*4
37 楼
请问一下你的donor vector咋设计的呢？是ssODN吗？用了多长的homologous arm呢？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
s*r
38 楼
用loxp带抗性基因，放到mutation位点附近的intron里去不就可以了。
d*s
39 楼
好主意。我是外行。 请介绍怎么避免loxp和抗性基因被spliced out. 抗性基因在
intron怎么被表达?
【在 s********r 的大作中提到】
: 用loxp带抗性基因，放到mutation位点附近的intron里去不就可以了。
intron怎么被表达?
【在 s********r 的大作中提到】
: 用loxp带抗性基因，放到mutation位点附近的intron里去不就可以了。
m*D
40 楼
我克隆到质粒里面的。一边一个1。2Kb的arm,中间是70bp的mutation region,正好两个
新的酶位点连接，作克隆用。
【在 o**4 的大作中提到】
: 请问一下你的donor vector咋设计的呢？是ssODN吗？用了多长的homologous arm呢？
新的酶位点连接，作克隆用。
【在 o**4 的大作中提到】
: 请问一下你的donor vector咋设计的呢？是ssODN吗？用了多长的homologous arm呢？
m*D
41 楼
其实，如果这个selection marker expression cassette不影响intron/exon splicing
,切不切出来都无所谓的。如果影响，一个essential gene就不可能了。我这次作的一
个基因就是cell growth essential的。
【在 s********r 的大作中提到】
: 用loxp带抗性基因，放到mutation位点附近的intron里去不就可以了。
,切不切出来都无所谓的。如果影响，一个essential gene就不可能了。我这次作的一
个基因就是cell growth essential的。
【在 s********r 的大作中提到】
: 用loxp带抗性基因，放到mutation位点附近的intron里去不就可以了。
b*r
42 楼
对CRISPR 的细节不清楚，只是想了解下，理论上你这个点突变的方法（或者其他已有
的点突变方法）有没有可能做到很高的效率，比如80%之类的？或者哪怕是30-40%？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
的点突变方法）有没有可能做到很高的效率，比如80%之类的？或者哪怕是30-40%？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
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