有人同觉得chip-seq比chip-pcr好做么？# Biology - 生物学
m*5
1 楼
做个chip-pcr总是疑神疑鬼的
不像chip-seq, sites是否可靠和边上background和input,igG control一比就清楚了
不像chip-seq, sites是否可靠和边上background和input,igG control一比就清楚了
l*s
2 楼
正解
m*5
3 楼
有同感？
【在 l********s 的大作中提到】
: 正解
【在 l********s 的大作中提到】
: 正解
m*5
4 楼
刚看到你在另一个贴里的问题
你还说sequencing么？
【在 l********s 的大作中提到】
: 正解
你还说sequencing么？
【在 l********s 的大作中提到】
: 正解
z*t
5 楼
开个玩笑，ChIP－qPCR总能拿到你想要的enrichment
不过我觉得比较relative enrichment还是可以的，只要你用的ChIP抗体好用
【在 m******5 的大作中提到】
: 做个chip-pcr总是疑神疑鬼的
: 不像chip-seq, sites是否可靠和边上background和input,igG control一比就清楚了
不过我觉得比较relative enrichment还是可以的，只要你用的ChIP抗体好用
【在 m******5 的大作中提到】
: 做个chip-pcr总是疑神疑鬼的
: 不像chip-seq, sites是否可靠和边上background和input,igG control一比就清楚了
a*r
6 楼
chip qpcr 不确定性太大了，你看那一个个巨大的error bar就知道了
不要质疑chipqpcr数据的可靠性，浑水咱蹚不起
不要质疑chipqpcr数据的可靠性，浑水咱蹚不起
m*5
7 楼
nice to know that I am not just being paranoid.
k*n
8 楼
qpcr'手一抖'就什么结果都能做出来了╮(╯▽╰)╭
好多烙印的qpcr结果都不能信。seq手抖就不好弄了
好多烙印的qpcr结果都不能信。seq手抖就不好弄了
K*R
9 楼
我觉得只要到足够强信号binding 位点上。chip pcr 还是很靠谱的
g*3
10 楼
有点不同意见，说出来大家讨论下。
1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
才算是可靠的。
3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
很可靠的：
crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
准，自己的实验是不是很可靠了（这个实验其实用Input做啥normalize的都没有必要了
）。
至于那些error bar太大了，primer是不是可靠的，sample（尤其是input）有没有做过
dilution的standard curve，primer有没有做过PCR effiency test （这还算是要求高
点的，我还见过JCI这样的杂志Forward primer不是unique的，这样的问题可能在你用
Input/Too much IP DNA的时候就有问题了）
4. qPCR感觉比SEQ好做是正常的，因为SEQ关注整体嘛，有结果就是好的，QPCR做不出
来就发表不了了。 另外QPCR的实验体系一般都有treatment啥乱七八糟的，seq很多就
是一个Input和IP（也有case-control的，这样的其实就算是复杂的了，原因是数据处
理起来会复杂一些，这里的pipeline还不是很多）。有些实验条件也不尽一样：qPCR你
的DNA可以长点没关系，seq就不好了，QPCR即使你OVER-crosslink也不是很要紧，只要
你的目标不受影响，但是SEQ可能会由于tag NA导致DNA太少。
欢迎修正。
【在 k*****n 的大作中提到】
: qpcr'手一抖'就什么结果都能做出来了╮(╯▽╰)╭
: 好多烙印的qpcr结果都不能信。seq手抖就不好弄了
1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
才算是可靠的。
3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
很可靠的：
crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
准，自己的实验是不是很可靠了（这个实验其实用Input做啥normalize的都没有必要了
）。
至于那些error bar太大了，primer是不是可靠的，sample（尤其是input）有没有做过
dilution的standard curve，primer有没有做过PCR effiency test （这还算是要求高
点的，我还见过JCI这样的杂志Forward primer不是unique的，这样的问题可能在你用
Input/Too much IP DNA的时候就有问题了）
4. qPCR感觉比SEQ好做是正常的，因为SEQ关注整体嘛，有结果就是好的，QPCR做不出
来就发表不了了。 另外QPCR的实验体系一般都有treatment啥乱七八糟的，seq很多就
是一个Input和IP（也有case-control的，这样的其实就算是复杂的了，原因是数据处
理起来会复杂一些，这里的pipeline还不是很多）。有些实验条件也不尽一样：qPCR你
的DNA可以长点没关系，seq就不好了，QPCR即使你OVER-crosslink也不是很要紧，只要
你的目标不受影响，但是SEQ可能会由于tag NA导致DNA太少。
欢迎修正。
【在 k*****n 的大作中提到】
: qpcr'手一抖'就什么结果都能做出来了╮(╯▽╰)╭
: 好多烙印的qpcr结果都不能信。seq手抖就不好弄了
m*5
11 楼
哈哈你说的没错，不过那是在binding sites和functional hypothesis已经很清楚的情况
我其实是说在binding sites未知的情况下
IP
【在 g*********3 的大作中提到】
: 有点不同意见，说出来大家讨论下。
: 1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
: 0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
: 2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
: 才算是可靠的。
: 3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
: 很可靠的：
: crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
: 我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
: 的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
我其实是说在binding sites未知的情况下
IP
【在 g*********3 的大作中提到】
: 有点不同意见，说出来大家讨论下。
: 1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
: 0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
: 2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
: 才算是可靠的。
: 3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
: 很可靠的：
: crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
: 我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
: 的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
d*s
12 楼
学习了！
IP
【在 g*********3 的大作中提到】
: 有点不同意见，说出来大家讨论下。
: 1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
: 0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
: 2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
: 才算是可靠的。
: 3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
: 很可靠的：
: crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
: 我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
: 的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
IP
【在 g*********3 的大作中提到】
: 有点不同意见，说出来大家讨论下。
: 1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
: 0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
: 2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
: 才算是可靠的。
: 3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
: 很可靠的：
: crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
: 我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
: 的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
a*r
13 楼
我觉得你这样的做PCR 等于瞎子摸象，还不如先花点钱做几个seq，看看哪里有
enrichment再用pcr去做treatment comparison。
情况
【在 m******5 的大作中提到】
: 哈哈你说的没错，不过那是在binding sites和functional hypothesis已经很清楚的情况
: 我其实是说在binding sites未知的情况下
:
: IP
enrichment再用pcr去做treatment comparison。
情况
【在 m******5 的大作中提到】
: 哈哈你说的没错，不过那是在binding sites和functional hypothesis已经很清楚的情况
: 我其实是说在binding sites未知的情况下
:
: IP
m*5
14 楼
都有做，就是感觉对于小peak来说sequencing更可靠
【在 a******r 的大作中提到】
: 我觉得你这样的做PCR 等于瞎子摸象，还不如先花点钱做几个seq，看看哪里有
: enrichment再用pcr去做treatment comparison。
:
: 情况
【在 a******r 的大作中提到】
: 我觉得你这样的做PCR 等于瞎子摸象，还不如先花点钱做几个seq，看看哪里有
: enrichment再用pcr去做treatment comparison。
:
: 情况
n*e
15 楼
个人觉得ChIP-qPCR误差太大，但是增减趋势如果是可重复的话还是可信的。
a*g
16 楼
新手刚开始做这块，想顺便请教大家这两者在fold enrichment方面的问题。我用chip
－pcr测得chip sample在该TF的经典target上，跟ip相比有上百倍的变化。同样的样品
送去chip seq，虽然经典target依然是变化最大的，但是fold change只有20几倍。这
是为什么呢？
－pcr测得chip sample在该TF的经典target上，跟ip相比有上百倍的变化。同样的样品
送去chip seq，虽然经典target依然是变化最大的，但是fold change只有20几倍。这
是为什么呢？
a*r
17 楼
chip pcr 还是用percent input 比较好吧。倍数变化在pcr跟seq之间没办法做直接比
较。好像pcr的amplicon 无法直接跟测序的fragment做比较？
我对seq 经验有限，还请大仙来指教
chip
【在 a*******g 的大作中提到】
: 新手刚开始做这块，想顺便请教大家这两者在fold enrichment方面的问题。我用chip
: －pcr测得chip sample在该TF的经典target上，跟ip相比有上百倍的变化。同样的样品
: 送去chip seq，虽然经典target依然是变化最大的，但是fold change只有20几倍。这
: 是为什么呢？
较。好像pcr的amplicon 无法直接跟测序的fragment做比较？
我对seq 经验有限，还请大仙来指教
chip
【在 a*******g 的大作中提到】
: 新手刚开始做这块，想顺便请教大家这两者在fold enrichment方面的问题。我用chip
: －pcr测得chip sample在该TF的经典target上，跟ip相比有上百倍的变化。同样的样品
: 送去chip seq，虽然经典target依然是变化最大的，但是fold change只有20几倍。这
: 是为什么呢？
c*1
18 楼
关于这个standard curve，我想探讨下。
我们老板，要求我们每次qPCR，对每对primer都要用input的dilution做standard
curve。而且要用定量的input做standard curve （10, 1, 0.1, 0.01 ng/ul）然后
sample的定量就用这个standard curve。我觉得更合理的做法是，应该是根据实际IP的
样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve。这个问
题，跟他争论了好几次，后来就懒得跟他争了。
另外，至于就是是否需要每次都做standard curve？我觉得其实是没有必要的，甚至用
input做standard curve是完全不需要的。standard curve本身的目的就是为了计算
primer的efficiency，以方便定量。其实，模板的量，也会影响primer的efficiency，
primer对input样品的effficiency不一定跟IP样品的一样。而且，qPCR本身是有每次
PCR循环的数据的。根据linear range的扩增曲线，是很容易算出primer的efficiency
的（有的软件会自动给出这个值），然后可以根据这个来定量。
sample（尤其是input）有没有做过dilution的standard curve
【在 g*********3 的大作中提到】
: 有点不同意见，说出来大家讨论下。
: 1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
: 0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
: 2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
: 才算是可靠的。
: 3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
: 很可靠的：
: crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
: 我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
: 的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
我们老板，要求我们每次qPCR，对每对primer都要用input的dilution做standard
curve。而且要用定量的input做standard curve （10, 1, 0.1, 0.01 ng/ul）然后
sample的定量就用这个standard curve。我觉得更合理的做法是，应该是根据实际IP的
样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve。这个问
题，跟他争论了好几次，后来就懒得跟他争了。
另外，至于就是是否需要每次都做standard curve？我觉得其实是没有必要的，甚至用
input做standard curve是完全不需要的。standard curve本身的目的就是为了计算
primer的efficiency，以方便定量。其实，模板的量，也会影响primer的efficiency，
primer对input样品的effficiency不一定跟IP样品的一样。而且，qPCR本身是有每次
PCR循环的数据的。根据linear range的扩增曲线，是很容易算出primer的efficiency
的（有的软件会自动给出这个值），然后可以根据这个来定量。
sample（尤其是input）有没有做过dilution的standard curve
【在 g*********3 的大作中提到】
: 有点不同意见，说出来大家讨论下。
: 1. 如果是error bar太大了，是不是要考虑实验重做。我个人觉得replicates内部Ct在
: 0.3左右都可以接受，有些人要求严格的在0.1左右，否则就重做了。
: 2. 现在大家paper里好像也不强调biological replicate了。至少我觉得实验重复几次
: 才算是可靠的。
: 3. 如果不是实验系统本身的复杂性，控制好了以下几个因素，CHIP-QPCR的结果应该是
: 很可靠的：
: crosslinking, sonication, Ab/Beads, reverse-crosslinking.
: 我一般处理CHIP-SEQ/QPCR都有大概10个sample，每个sample的Input(包括Mock 和 IP
: 的), Mock IP.etc，这些sample的Ct应该要接近甚至一样才算可靠，所以你应该有个标
z*t
19 楼
【在 c****1 的大作中提到】
: 关于这个standard curve，我想探讨下。
: 我们老板，要求我们每次qPCR，对每对primer都要用input的dilution做standard
: curve。而且要用定量的input做standard curve （10, 1, 0.1, 0.01 ng/ul）然后
: sample的定量就用这个standard curve。我觉得更合理的做法是，应该是根据实际IP的
: 样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve。这个问
: 题，跟他争论了好几次，后来就懒得跟他争了。
: 另外，至于就是是否需要每次都做standard curve？我觉得其实是没有必要的，甚至用
: input做standard curve是完全不需要的。standard curve本身的目的就是为了计算
: primer的efficiency，以方便定量。其实，模板的量，也会影响primer的efficiency，
: primer对input样品的effficiency不一定跟IP样品的一样。而且，qPCR本身是有每次
r*e
20 楼
顺便问一个问题
我做CHIP-PCR （qPCR之前先做standard PCR），但为啥连input都P不出条带呢？
input已经在gel检测过是有smear的
我能想到的就是：可能我的primer设计P出来的amplico size太长了。。。以为对于
sheared DNA作为模板大概也就300bp左右吧。。。我想请问各位primer design的
amplicon大概多长呢
thx
【在 m******5 的大作中提到】
: 做个chip-pcr总是疑神疑鬼的
: 不像chip-seq, sites是否可靠和边上background和input,igG control一比就清楚了
我做CHIP-PCR （qPCR之前先做standard PCR），但为啥连input都P不出条带呢？
input已经在gel检测过是有smear的
我能想到的就是：可能我的primer设计P出来的amplico size太长了。。。以为对于
sheared DNA作为模板大概也就300bp左右吧。。。我想请问各位primer design的
amplicon大概多长呢
thx
【在 m******5 的大作中提到】
: 做个chip-pcr总是疑神疑鬼的
: 不像chip-seq, sites是否可靠和边上background和input,igG control一比就清楚了
t*n
21 楼
交流交流，谢谢。
1.关于standard curve, 我的理解就是确认PCR amplication efficiency,只要你的样
品DNA好的，为什么一定要用实际IP的
样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve？当然
如果模板浓度太低，amplication curve may be an issue。
我过去的经验是cDNA样品反复冻融会影响amplication efficiency.
此外如果倍数差别很大比如10倍以上的话就没有必要做standard curve，因为即使扩增
效率低也不会影响到最终结果。
我觉得对一对引物做一次就够了。
2 “qPCR本身是有每次
PCR循环的数据的。根据linear range的扩增曲线，是很容易算出primer的efficiency
的（有的软件会自动给出这个值），然后可以根据这个来定量。”
我以前想过机器应该能自动给出这个效率，但从来没见过，楼主能否说出具体的机器或
软件？
关于这个standard curve，我想探讨下。
我们老板，要求我们每次qPCR，对每对primer都要用input的dilution做standard
curve。而且要用定量的input做standard curve （10, 1, 0.1, 0.01 ng/ul）然后
sample的定量就用这个standard curve。我觉得更合理的做法是，应该是根据实际IP的
样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve。这个问
题，跟他争论了好几次，后来就懒得跟他争了。
另外，至于就是是否需要每次都做standard curve？我觉得其实是没有必要的，甚至用
input做standard curve是完全不需要的。standard curve本身的目的就是为了计算
primer的efficiency，以方便定量。其实，模板的量，也会影响primer的efficiency，
primer对input样品的effficiency不一定跟IP样品的一样。而且，qPCR本身是有每次
PCR循环的数据的。根据linear range的扩增曲线，是很容易算出primer的efficiency
的（有的软件会自动给出这个值），然后可以根据这个来定量。
【在 c****1 的大作中提到】
: 关于这个standard curve，我想探讨下。
: 我们老板，要求我们每次qPCR，对每对primer都要用input的dilution做standard
: curve。而且要用定量的input做standard curve （10, 1, 0.1, 0.01 ng/ul）然后
: sample的定量就用这个standard curve。我觉得更合理的做法是，应该是根据实际IP的
: 样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve。这个问
: 题，跟他争论了好几次，后来就懒得跟他争了。
: 另外，至于就是是否需要每次都做standard curve？我觉得其实是没有必要的，甚至用
: input做standard curve是完全不需要的。standard curve本身的目的就是为了计算
: primer的efficiency，以方便定量。其实，模板的量，也会影响primer的efficiency，
: primer对input样品的effficiency不一定跟IP样品的一样。而且，qPCR本身是有每次
1.关于standard curve, 我的理解就是确认PCR amplication efficiency,只要你的样
品DNA好的，为什么一定要用实际IP的
样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve？当然
如果模板浓度太低，amplication curve may be an issue。
我过去的经验是cDNA样品反复冻融会影响amplication efficiency.
此外如果倍数差别很大比如10倍以上的话就没有必要做standard curve，因为即使扩增
效率低也不会影响到最终结果。
我觉得对一对引物做一次就够了。
2 “qPCR本身是有每次
PCR循环的数据的。根据linear range的扩增曲线，是很容易算出primer的efficiency
的（有的软件会自动给出这个值），然后可以根据这个来定量。”
我以前想过机器应该能自动给出这个效率，但从来没见过，楼主能否说出具体的机器或
软件？
关于这个standard curve，我想探讨下。
我们老板，要求我们每次qPCR，对每对primer都要用input的dilution做standard
curve。而且要用定量的input做standard curve （10, 1, 0.1, 0.01 ng/ul）然后
sample的定量就用这个standard curve。我觉得更合理的做法是，应该是根据实际IP的
样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve。这个问
题，跟他争论了好几次，后来就懒得跟他争了。
另外，至于就是是否需要每次都做standard curve？我觉得其实是没有必要的，甚至用
input做standard curve是完全不需要的。standard curve本身的目的就是为了计算
primer的efficiency，以方便定量。其实，模板的量，也会影响primer的efficiency，
primer对input样品的effficiency不一定跟IP样品的一样。而且，qPCR本身是有每次
PCR循环的数据的。根据linear range的扩增曲线，是很容易算出primer的efficiency
的（有的软件会自动给出这个值），然后可以根据这个来定量。
【在 c****1 的大作中提到】
: 关于这个standard curve，我想探讨下。
: 我们老板，要求我们每次qPCR，对每对primer都要用input的dilution做standard
: curve。而且要用定量的input做standard curve （10, 1, 0.1, 0.01 ng/ul）然后
: sample的定量就用这个standard curve。我觉得更合理的做法是，应该是根据实际IP的
: 样品量（1/20, 1/200, 1/2000 and 1/2000 of ChIP input）standard curve。这个问
: 题，跟他争论了好几次，后来就懒得跟他争了。
: 另外，至于就是是否需要每次都做standard curve？我觉得其实是没有必要的，甚至用
: input做standard curve是完全不需要的。standard curve本身的目的就是为了计算
: primer的efficiency，以方便定量。其实，模板的量，也会影响primer的efficiency，
: primer对input样品的effficiency不一定跟IP样品的一样。而且，qPCR本身是有每次
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