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cas9/CRISPR 请教
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cas9/CRISPR 请教# Biology - 生物学
Q*G
1 楼
想在目的基因的N端或C端knockin GFP
利用cas9n d10a 载体，分别克隆２ guild RNA。
Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。５＇和３＇flank分别为８００bp左
右.转染（LTX／Fugene HD）完３天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱，还可以做细
胞分选么？
通常转染后多久细胞分选?
是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率？
谢谢
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Q*G
2 楼
顶一下
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Q*G
3 楼
请大牛们不吝赐教
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s*r
4 楼
没有selection marker的话没办法富集，荧光弱不代表没有，继续往下做FACS就是了。
如果想心里有个谱的话，可以在FACS前一天，收一部分细胞，用genomic DNA做PCR检测
GFP integration，如果这个PCR都是negative的话就说明失败了，不用去做FACS了。

【在 Q*****G 的大作中提到】
: 想在目的基因的N端或C端knockin GFP
: 利用cas9n d10a 载体，分别克隆２ guild RNA。
: Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。５＇和３＇flank分别为８００bp左
: 右.转染（LTX／Fugene HD）完３天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱，还可以做细
: 胞分选么？
: 通常转染后多久细胞分选?
: 是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率？
: 谢谢
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l*e
5 楼
d10a不好用，建议wildtype CAS9

【在 Q*****G 的大作中提到】
: 想在目的基因的N端或C端knockin GFP
: 利用cas9n d10a 载体，分别克隆２ guild RNA。
: Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。５＇和３＇flank分别为８００bp左
: 右.转染（LTX／Fugene HD）完３天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱，还可以做细
: 胞分选么？
: 通常转染后多久细胞分选?
: 是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率？
: 谢谢
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Q*G
6 楼
Thanks a lot!
Have already tried wt cas9, worry about higher off target effect.
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