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构建stable cell line的时候，linearize plasmid 怎么选择位点呢？

构建stable cell line的时候，linearize plasmid 怎么选择位点呢？# Biology - 生物学

c*r2015-10-22 07:10

1 楼

想申请citi的simplicity卡，主要是看上了这张卡18个月的0 apr期，但是在citi已经
有两张卡了，而且额度还很高。现在要申请新卡，先把老卡关掉会不会提高成功率，否
则会被“因在本行额度过高”的原因而拒绝？或者能否和客服商量，把老卡convert成
新卡？请高人指教，谢谢！

c*z2015-10-22 07:10

2 楼

请教各位Fragomen的case,
本人09月中旬file的PWD到现在还没有批，是这个速度吗? 还是什么地方出问题了，
有朋友说网上可以查到这个PWD处理到哪一个月了，是这样的吗。如果是，哪位能否给
给网址？
多谢了

f*a2015-10-22 07:10

3 楼

岁月是把杀猪刀
但是杀不了八万这样永远青春米貌的无敌帅哥猫
4年过去了，没有任何变化
包括那一身胖肉
刚来的时候
后来
现在

s*o2015-10-22 07:10

4 楼

http://www.microsoftstore.com/store/msstore/pd/productID.259456
这配置，这价格...
不知道能不能自己升级内存

f*d2015-10-22 07:10

5 楼

虽然做了很多年生物，但是惭愧都没有构建过stable cell line，做之前请教一下做
过的前辈们。看到一些protocol说要先linearize plasmid，怎么选择位点呢？酶切之
后能用换buffer的那种column 来clean up吗？
此外HEK293T可以用pCDNA6来构建stable cell line吗？
谢啦～

s*g2015-10-22 07:10

6 楼

chase那里大家的通用做法是留老卡，申新卡，没过的话要求挪老卡cl甚至关老卡来开
新卡，相对来说很保险
citi的话，由于貌似很难挪cl，如果新卡没过，你也许可以和客服要求关老卡开新卡。
转卡需要是同类卡才能转。
但对citi，是否这才是最佳途径，我不保证。
毕竟，关卡会影响信用分啊。。。

T*G2015-10-22 07:10

7 楼

你这个多半是PW高过你当前工资太多了，你们公司不批准。

w*w2015-10-22 07:10

8 楼

嘖嘖，我原本以為我們這種接手老貓的家長沒處發揮了，看到兔子的帖才發現，我們還
是有餘熱可用的啊！
P.S.八萬真是沒腰啊～～

m*y2015-10-22 07:10

9 楼

可以切也可以不切
酶切选择的时候肯定是单位点，不要切坏抗性序列，不要切坏你的kd or tag-your
gene序列
切后可以用乙醇沉淀回收
pcDNA6可以用来建立stable cell line

j*a2015-10-22 07:10

10 楼

搭车问一下, 对chase而言，如果是同样的卡（比如有一张UA mileage在手），也能打
电话关老卡开新卡吗(再开一张UA)?

【在 s**********g 的大作中提到】

: chase那里大家的通用做法是留老卡，申新卡，没过的话要求挪老卡cl甚至关老卡来开
: 新卡，相对来说很保险
: citi的话，由于貌似很难挪cl，如果新卡没过，你也许可以和客服要求关老卡开新卡。
: 转卡需要是同类卡才能转。
: 但对citi，是否这才是最佳途径，我不保证。
: 毕竟，关卡会影响信用分啊。。。

a*g2015-10-22 07:10

11 楼

嗯，可能是又file了一次。6-8周是正常速度

【在 T**G 的大作中提到】

: 你这个多半是PW高过你当前工资太多了，你们公司不批准。

t*i2015-10-22 07:10

12 楼

八万的沙发是一定要坐的

m*D2015-10-22 07:10

13 楼

看你的selection marker和要表达的基因是不是在同一个vector上。不是的话，你两个
都要切。
以前作knockout的时候，读过的资料是这么解释的：所有integration都是因同源
sequence导致的。一个圆的plasmid,一个点和genoome的一个点match后，integration
往往就是一个copy进去，而一个线性的DNA片断，往往会有很多拷贝进同一个点。你要
有两个plasmid，你就只能切了，不然，两个不同点的integration很难同时在一个细胞
里发生。我作stable,都切，希望一下子能多进几个拷贝。另外，环状的plasmid的
integration可以发生在plasmid的任何地方，如果正好发生在你的expression
cassette之类，就是integrated,也可能不表达你要的东西。
切点很容易，就是找一个酶位点，只要在你的expression cassette（包括你自己的基
因和selection marker)之外就行。你知道vector的来源的话，一般公司的网站上会有
map告诉你这些cassette的起点和终点的。

【在 f*******d 的大作中提到】

: 虽然做了很多年生物，但是惭愧都没有构建过stable cell line，做之前请教一下做
: 过的前辈们。看到一些protocol说要先linearize plasmid，怎么选择位点呢？酶切之
: 后能用换buffer的那种column 来clean up吗？
: 此外HEK293T可以用pCDNA6来构建stable cell line吗？
: 谢啦～

s*g2015-10-22 07:10

14 楼

你干嘛要这样开
如果是开卡优惠
你那样应该是弄不到开卡优惠的

【在 j***a 的大作中提到】

:
: 搭车问一下, 对chase而言，如果是同样的卡（比如有一张UA mileage在手），也能打
: 电话关老卡开新卡吗(再开一张UA)?

c*z2015-10-22 07:10

15 楼

今天公司 HR老大说PWD是分区处理的，所以同时file的有些已经处理了，有些区还没有
处理，求证实

t*i2015-10-22 07:10

16 楼

原来是板凳和地毯
八万最绝的不是一身肉，是表情，淡定得不得了

D*a2015-10-22 07:10

17 楼

amp抗性的质粒可以选择scaI或PvuI
kan抗性的可以选择puvI，NruI或SspI
都是细菌抗性基因上的位点。

a*g2015-10-22 07:10

18 楼

不会吧？PWD是在Department of Labor 处理。难道劳工部也分地区？

【在 c**z 的大作中提到】

: 今天公司 HR老大说PWD是分区处理的，所以同时file的有些已经处理了，有些区还没有
: 处理，求证实

f*a2015-10-22 07:10

19 楼

谢谢支持，看看我的扑克脸，和胡core比谁厉害？

m*o2015-10-22 07:10

20 楼

我天天在做，不用切的，只要表达效率高，筛选过后，很容易挑到正确的

c*z2015-10-22 07:10

21 楼

Fragomen律师说，9月file的 PWD政府shut down弄丢了，11月又file了一次，大家觉得
有可能政府把file的PWD弄丢了吗？
我觉得律师可能在说谎

s*r2015-10-22 07:10

22 楼

lol
这个，见面以前已经杀过了

【在 f***a 的大作中提到】

: 岁月是把杀猪刀
: 但是杀不了八万这样永远青春米貌的无敌帅哥猫
: 4年过去了，没有任何变化
: 包括那一身胖肉
: 刚来的时候
: 后来
: 现在

f*d2015-10-22 07:10

23 楼

多谢各位前辈指点！
再问一下筛选的方法。是不是平板转化之后两三天换成抗性筛选培养基，然后一个星期
之后细胞死了一大半只剩下稳定转化的了，这个时候就稀释，然后seed 1－2个细胞到
96孔板里养single colony?
这个还是工作量挺大大，显微镜下面96个孔全部看一遍都要好久，如果几个板看下来一
天就不用干其它活了。。。。
大家通常筛选有啥简单有效的好办法呢？

c*z2015-10-22 07:10

24 楼

挨千刀的Fragomen律师

h*o2015-10-22 07:10

25 楼

八万把"岁月“给杀了

s*r2015-10-22 07:10

26 楼

转染效率高的话不需要做single colony，推荐用piggybac系统，超级方便，不用挑克
隆，筛一个星期就能养起来做实验了。

c*z2015-10-22 07:10

27 楼

挨千刀的Fragomen律师

f*n2015-10-22 07:10

28 楼

re

【在 h********o 的大作中提到】

: 八万把"岁月“给杀了

m*D2015-10-22 07:10

29 楼

转化完后，我等一天，让细胞recovery.然后就上selection. G418用得比较多，你最好
在转化之前据测一个dose,看多少量能在7-10天杀死里的所有host cell. 太高太低都会
有问题。
看细胞生长速度。一般24小时divide一次的细胞，筛选一般要两三个礼拜。我习惯用
100 mm dish,一直加G418，到肉眼可以看到colonies,然后用20 ul的pipette,带消毒过
的tip，在显微镜下挑。
挑的过程如下：
100 mm dish用PBS洗两次，然后放10-12 ml PBS在dish里面。显微镜放进hood,放dish
的平台在hood门后面，保持消毒状态。把dish放上去，显微镜下找到colony,先把
pipette里的空气打出来，再用tip对准colony,轻轻撮一下，让细胞脱离dish,然后手指
一松，就把那团细胞吸进了tip。这20 ul的细胞带PBS放进96-well的平板里，加20 ul
trypsin, RT处理5-10分钟，加100 ul medium就可以转移到别的平板里了。看colony大
小，很多时候我就直接进24-well plate,然后进T25。挑之前最好不要喝咖啡，尤其加
糖的咖啡，防止手哆嗦。：）。
Good luck!

【在 f*******d 的大作中提到】

: 多谢各位前辈指点！
: 再问一下筛选的方法。是不是平板转化之后两三天换成抗性筛选培养基，然后一个星期
: 之后细胞死了一大半只剩下稳定转化的了，这个时候就稀释，然后seed 1－2个细胞到
: 96孔板里养single colony?
: 这个还是工作量挺大大，显微镜下面96个孔全部看一遍都要好久，如果几个板看下来一
: 天就不用干其它活了。。。。
: 大家通常筛选有啥简单有效的好办法呢？

l*l2015-10-22 07:10

30 楼

无赖Fragomen律师

【在 c**z 的大作中提到】

: Fragomen律师说，9月file的 PWD政府shut down弄丢了，11月又file了一次，大家觉得
: 有可能政府把file的PWD弄丢了吗？
: 我觉得律师可能在说谎

w*j2015-10-22 07:10

31 楼

八万巨有范

f*d2015-10-22 07:10

32 楼

这个好详细好详细！多谢指点！

dish

【在 m*********D 的大作中提到】

: 转化完后，我等一天，让细胞recovery.然后就上selection. G418用得比较多，你最好
: 在转化之前据测一个dose,看多少量能在7-10天杀死里的所有host cell. 太高太低都会
: 有问题。
: 看细胞生长速度。一般24小时divide一次的细胞，筛选一般要两三个礼拜。我习惯用
: 100 mm dish,一直加G418，到肉眼可以看到colonies,然后用20 ul的pipette,带消毒过
: 的tip，在显微镜下挑。
: 挑的过程如下：
: 100 mm dish用PBS洗两次，然后放10-12 ml PBS在dish里面。显微镜放进hood,放dish
: 的平台在hood门后面，保持消毒状态。把dish放上去，显微镜下找到colony,先把
: pipette里的空气打出来，再用tip对准colony,轻轻撮一下，让细胞脱离dish,然后手指