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western比较一个蛋白含量,上样怎么控制?
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western比较一个蛋白含量,上样怎么控制?# Biology - 生物学
M*9
1
上周一on site,第一个candidate,第二个还没有面。这周HM打电话说是Top
candidate,HR会联系,然后HR联系问搬家费的问题,说让搬家公司和我联系估价,不
知道什么意思?出个Offer真难!
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n*e
2
研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
,总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的,考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
不一样,但总量估计是差不多,符合公司的标量。但是用actin做,正常样品估计只有
肿瘤样品actin的十分之一。问题来了,怎么比较这个蛋白的含量?
很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
做control吗?被接受程度都差不多?
谢谢!
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w*r
3
BCA测测浓度?如果考马斯蓝条带差太多,就是公司浓度不准吧,看到不少paper用考马
斯蓝证明loading接近,不用house keeping

【在 n******e 的大作中提到】
: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ,总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的,考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样,但总量估计是差不多,符合公司的标量。但是用actin做,正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了,怎么比较这个蛋白的含量?
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗?被接受程度都差不多?
: 谢谢!

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n*e
4
怪我没有讲清楚。我是想问,对于用WB半定量比较某个蛋白在正常组织和肿瘤组织的表
达量,一般是用某个house keeping做参照还是控制不同样品的总的蛋白量一致。
多谢你的回答,看来你看文献多是用总蛋白量一致,我看了一些,好多是用actin/
GAPDH之类的做参照。
公司提供的裂解蛋白总蛋白量应该是对的,只是不同分子量的蛋白丰度在正常组织和肿
瘤组织差别很大。所以我发现没有办法用actin做参照,总蛋白量一样的情况下,相差
几乎有十倍。
对于这种临床蛋白样品,是不是很多都是这样的?

【在 w*****r 的大作中提到】
: BCA测测浓度?如果考马斯蓝条带差太多,就是公司浓度不准吧,看到不少paper用考马
: 斯蓝证明loading接近,不用house keeping

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x*d
5

你得考虑ACTA1对你的样品来说是不是一个好的loading control。先换一个control试
试,比如GAPDH

【在 n******e 的大作中提到】
: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ,总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的,考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样,但总量估计是差不多,符合公司的标量。但是用actin做,正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了,怎么比较这个蛋白的含量?
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗?被接受程度都差不多?
: 谢谢!

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n*e
6
研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
,总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的,考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
不一样,但总量估计是差不多,符合公司的标量。但是用actin做,正常样品估计只有
肿瘤样品actin的十分之一。问题来了,怎么比较这个蛋白的含量?
很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
做control吗?被接受程度都差不多?
谢谢!
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w*r
7
BCA测测浓度?如果考马斯蓝条带差太多,就是公司浓度不准吧,看到不少paper用考马
斯蓝证明loading接近,不用house keeping

【在 n******e 的大作中提到】
: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ,总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的,考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样,但总量估计是差不多,符合公司的标量。但是用actin做,正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了,怎么比较这个蛋白的含量?
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗?被接受程度都差不多?
: 谢谢!

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n*e
8
怪我没有讲清楚。我是想问,对于用WB半定量比较某个蛋白在正常组织和肿瘤组织的表
达量,一般是用某个house keeping做参照还是控制不同样品的总的蛋白量一致。
多谢你的回答,看来你看文献多是用总蛋白量一致,我看了一些,好多是用actin/
GAPDH之类的做参照。
公司提供的裂解蛋白总蛋白量应该是对的,只是不同分子量的蛋白丰度在正常组织和肿
瘤组织差别很大。所以我发现没有办法用actin做参照,总蛋白量一样的情况下,相差
几乎有十倍。
对于这种临床蛋白样品,是不是很多都是这样的?

【在 w*****r 的大作中提到】
: BCA测测浓度?如果考马斯蓝条带差太多,就是公司浓度不准吧,看到不少paper用考马
: 斯蓝证明loading接近,不用house keeping

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x*d
9

你得考虑ACTA1对你的样品来说是不是一个好的loading control。先换一个control试
试,比如GAPDH

【在 n******e 的大作中提到】
: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ,总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的,考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样,但总量估计是差不多,符合公司的标量。但是用actin做,正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了,怎么比较这个蛋白的含量?
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗?被接受程度都差不多?
: 谢谢!

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l*y
10
看这篇:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.200400941/epdf
我刚入行的时候看得是另一篇类似的,但是更细致,给出了不同问题在细胞内不同位置
的蛋白质的好的和差的 loading control,就是现在一时没找到。另外 western 和
pcr 的 control 有时候标准也不一样。

【在 n******e 的大作中提到】
: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ,总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的,考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样,但总量估计是差不多,符合公司的标量。但是用actin做,正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了,怎么比较这个蛋白的含量?
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗?被接受程度都差不多?
: 谢谢!

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b*e
11
受教!恳请帮忙找一下你说的另一篇paper。

【在 l***y 的大作中提到】
: 看这篇:
: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.200400941/epdf
: 我刚入行的时候看得是另一篇类似的,但是更细致,给出了不同问题在细胞内不同位置
: 的蛋白质的好的和差的 loading control,就是现在一时没找到。另外 western 和
: pcr 的 control 有时候标准也不一样。

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C*4
12
可以作WB之前用丽春红染色,肉眼可以大概看的出上样是否均匀,然后计算机扫描然,
用软件做所有条带扫描,得到一个亮度值的和,最后和WB的亮度做个比例。
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n*e
13
谢谢指点。收藏了!
不过现在比较疑惑的问题是,这个比较蛋白在肿瘤和正常组织的表达那种方法合理:
是比较在一样的总蛋白中的表达量,还是通过一些house keeping基因的蛋白作为参照
来上样。
在培养的细胞中,这两种方法可能会比较一致。可在临床组织里,至少在我买到的两组
样品里差异还是很大的。这个在你的这篇文献里也有表现。
主要是样品太贵了,目标蛋白本身含量就少,要再去normalize,太费了。要不就不这
么纠结了。

【在 l***y 的大作中提到】
: 看这篇:
: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.200400941/epdf
: 我刚入行的时候看得是另一篇类似的,但是更细致,给出了不同问题在细胞内不同位置
: 的蛋白质的好的和差的 loading control,就是现在一时没找到。另外 western 和
: pcr 的 control 有时候标准也不一样。

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z*8
14

多试试几个house keep 基因。
每次转膜后Ponceau S staining,拍照。如果house keep基因不行,就用Ponceau S
staining.

【在 n******e 的大作中提到】
: 谢谢指点。收藏了!
: 不过现在比较疑惑的问题是,这个比较蛋白在肿瘤和正常组织的表达那种方法合理:
: 是比较在一样的总蛋白中的表达量,还是通过一些house keeping基因的蛋白作为参照
: 来上样。
: 在培养的细胞中,这两种方法可能会比较一致。可在临床组织里,至少在我买到的两组
: 样品里差异还是很大的。这个在你的这篇文献里也有表现。
: 主要是样品太贵了,目标蛋白本身含量就少,要再去normalize,太费了。要不就不这
: 么纠结了。

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n*e
15
我看也只有这个办法了。多谢了。

【在 z********8 的大作中提到】
:
: 多试试几个house keep 基因。
: 每次转膜后Ponceau S staining,拍照。如果house keep基因不行,就用Ponceau S
: staining.

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