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请教：双特异性抗体（BsAb）中杂质纯合体含量测定

请教：双特异性抗体（BsAb）中杂质纯合体含量测定# Biology - 生物学

d*g2019-05-17 07:05

1 楼

表达了一个双特异性抗体（Bispecific Antibody）AB，其中有少量杂质AA和BB。觉得
用离子交换柱很难把他们分开，去除； -过离子交换柱盐离子梯度洗脱时，只看到一个
主峰。我认为主峰大部分应该是目标抗体AB（火星测试显示有活性），可是如果里面混
入少量的AA和BB也有可能。请问如何可以比较精准的得知这个收集的主峰里面，AA和
BB的含量？我记得有个飞行时间的质谱，可以测组分中不同的蛋白的百分含量，请问
可以应用在这里吗？是否有其他方法？谢谢！

g*x2019-05-17 07:05

2 楼

native MS可以试试

【在 d*******g 的大作中提到】

: 表达了一个双特异性抗体（Bispecific Antibody）AB，其中有少量杂质AA和BB。觉得
: 用离子交换柱很难把他们分开，去除； -过离子交换柱盐离子梯度洗脱时，只看到一个
: 主峰。我认为主峰大部分应该是目标抗体AB（火星测试显示有活性），可是如果里面混
: 入少量的AA和BB也有可能。请问如何可以比较精准的得知这个收集的主峰里面，AA和
: BB的含量？我记得有个飞行时间的质谱，可以测组分中不同的蛋白的百分含量，请问
: 可以应用在这里吗？是否有其他方法？谢谢！

g*52019-05-17 07:05

3 楼

KIH 技术+common 轻链也会产生AA OR BB吗？

l*i2019-05-17 07:05

4 楼

knobs-into-holes 还是会有小量的AA 和BB的。我遇到的很多都小于5%。纯化时如果
普通的离子交换不好用的话，可以用hydrophobic的柱子或mix mode的柱子，例如
capto mmc 或 capto adhere。检测时如果分子量量差的多可以用non reduced ce sds
。或者reverse phase。

【在 g*********5 的大作中提到】

: KIH 技术+common 轻链也会产生AA OR BB吗？

d*g2019-05-17 07:05

5 楼

非常感谢！我会试一下您介绍的柱子。

sds

【在 l*****i 的大作中提到】

:
: knobs-into-holes 还是会有小量的AA 和BB的。我遇到的很多都小于5%。纯化时如果
: 普通的离子交换不好用的话，可以用hydrophobic的柱子或mix mode的柱子，例如
: capto mmc 或 capto adhere。检测时如果分子量量差的多可以用non reduced ce sds
: 。或者reverse phase。

d*g2019-05-17 07:05

6 楼

谢谢！我们公司现在没有质谱仪，需要将样品送出付费检测。请问一下 native MS应
该是大概率会得到想要的AA BB， AB的质量比率吧？或者，如果不能够保证测到这些
成分的比率，可能的原因会是什么呢？您能否多介绍一下？

【在 g*****x 的大作中提到】

: native MS可以试试

g*x2019-05-17 07:05

7 楼

AABBAB这种除非A和B质量太接近问题都不大。
比较麻烦的是LC和HC的misplace，比如A的LC和B的HC交换，这种质量和AB没区别，简单
的实验没法区分。
还有一个可以try一下的是ion mobility，不过这个和过柱子一样没法保证100%可以区
分。

【在 d*******g 的大作中提到】

: 谢谢！我们公司现在没有质谱仪，需要将样品送出付费检测。请问一下 native MS应
: 该是大概率会得到想要的AA BB， AB的质量比率吧？或者，如果不能够保证测到这些
: 成分的比率，可能的原因会是什么呢？您能否多介绍一下？

d*g2019-05-17 07:05

8 楼

非常感谢您的指教！
您是说用common light chain的情况下， AA，BB，AB只要A和B的重链分子量差别比较
大（我的case中A和B一条重链就有大于5K的差别），就会大概率用native MS的方法，
鉴定出纯化样品中AB，AA和BB的分子数量以及他们的比例，对吗？
您提到的LC和HC的misplace，是说在抗体蛋白表达的过程中，LC和HC会有交换发生？
这是在细胞中表达时随机发生的，还是说我们提前在构建载体的时候人为构建的？谢
谢！！

【在 g*****x 的大作中提到】

: AABBAB这种除非A和B质量太接近问题都不大。
: 比较麻烦的是LC和HC的misplace，比如A的LC和B的HC交换，这种质量和AB没区别，简单
: 的实验没法区分。
: 还有一个可以try一下的是ion mobility，不过这个和过柱子一样没法保证100%可以区
: 分。

d*g2019-05-17 07:05

9 楼

g*x2019-05-17 07:05

10 楼

表达过程中的杂质。如果share相同的LC不会出现这种状况。
在LC和HC都不同的情况下，预期产物是aABb，杂质aAAa，bBBb等等质量差异大很容易看
出来，但bABa质量和aABb一样。

: 非常感谢您的指教！

: 您是说用common light chain的情况下， AA，BB，AB只要A和B的重链分子量差
别比较

: 大（我的case中A和B一条重链就有大于5K的差别），就会大概率用native MS的
方法，

: 鉴定出纯化样品中AB，AA和BB的分子数量以及他们的比例，对吗？

: 您提到的LC和HC的misplace，是说在抗体蛋白表达的过程中，LC和HC会有交换发
生？

: 这是在细胞中表达时随机发生的，还是说我们提前在构建载体的时候人为构建的
？谢

: 谢！！

【在 d*******g 的大作中提到】

: 非常感谢您的指教！
: 您是说用common light chain的情况下， AA，BB，AB只要A和B的重链分子量差别比较
: 大（我的case中A和B一条重链就有大于5K的差别），就会大概率用native MS的方法，
: 鉴定出纯化样品中AB，AA和BB的分子数量以及他们的比例，对吗？
: 您提到的LC和HC的misplace，是说在抗体蛋白表达的过程中，LC和HC会有交换发生？
: 这是在细胞中表达时随机发生的，还是说我们提前在构建载体的时候人为构建的？谢
: 谢！！

d*g2019-05-17 07:05

11 楼

非常感谢您的详细回答！

【在 g*****x 的大作中提到】

: 表达过程中的杂质。如果share相同的LC不会出现这种状况。
: 在LC和HC都不同的情况下，预期产物是aABb，杂质aAAa，bBBb等等质量差异大很容易看
: 出来，但bABa质量和aABb一样。
:
:
: 非常感谢您的指教！
:
: 您是说用common light chain的情况下， AA，BB，AB只要A和B的重链分子量差
: 别比较
:
: 大（我的case中A和B一条重链就有大于5K的差别），就会大概率用native MS的
: 方法，
:
: 鉴定出纯化样品中AB，AA和BB的分子数量以及他们的比例，对吗？