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lentivirus表达问题求助

lentivirus表达问题求助# Biology - 生物学

w*e2015-12-17 08:12

1 楼

【以下文字转载自 I485 讨论区】
发信人: winthiscase (winthiscase), 信区: I485
标题: 结婚证一定要去国内公证吗？
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jul 8 09:30:32 2011, 美东)
要递交485了，才知道结婚证要公证。大家说是不是一定要国内的人帮办？谢谢！

D*a2015-12-17 08:12

2 楼

最近克隆了几个基因到lentiviral载体里，有大有小，大的5k，小的0.3k。在293T细胞
里和包装质粒共表达做病毒，之后感染HeLa，再用puro筛。没感染的细胞都杀死了，感
染的细胞puro筛后活下来的做免疫荧光，转了小基因的细胞只有1%的是阳性，转大基因
的细胞都是阴性。westernblot也做了，小基因的能弱弱的看见，大基因的是阴性。质
粒序列没问题。
为什么puro抗性转进去了，我的基因转不进去？需要经验丰富的专家解答，谢谢。

s*s2015-12-17 08:12

3 楼

puro和你的gene是2A在一起的，还是独立的

【在 D***a 的大作中提到】

: 最近克隆了几个基因到lentiviral载体里，有大有小，大的5k，小的0.3k。在293T细胞
: 里和包装质粒共表达做病毒，之后感染HeLa，再用puro筛。没感染的细胞都杀死了，感
: 染的细胞puro筛后活下来的做免疫荧光，转了小基因的细胞只有1%的是阳性，转大基因
: 的细胞都是阴性。westernblot也做了，小基因的能弱弱的看见，大基因的是阴性。质
: 粒序列没问题。
: 为什么puro抗性转进去了，我的基因转不进去？需要经验丰富的专家解答，谢谢。

D*a2015-12-17 08:12

4 楼

独立的吧，我用的是这个载体
http://www.addgene.org/39481/
在网上找到有人和我遇到一样的问题：
https://www.researchgate.net/post/What_to_do_with_a_false_positive_in_stable
_cell_select

【在 s******s 的大作中提到】

: puro和你的gene是2A在一起的，还是独立的

D*a2015-12-17 08:12

5 楼

我用过别的lentiviral vector过表达GFP和其他蛋白，没有selection marker，但我能
得到细胞几乎100%阳性。我认为我做病毒的方法是没问题的。

j*i2015-12-17 08:12

6 楼

如果你的目的蛋白有polyA且没有反方向放的话在293T细胞里会得到大量的不完整的
viral RNA 这种不完整的RNA即使能包装到病毒也是不能逆转录产生viral DNA的

stable

【在 D***a 的大作中提到】

: 独立的吧，我用的是这个载体
: http://www.addgene.org/39481/
: 在网上找到有人和我遇到一样的问题：
: https://www.researchgate.net/post/What_to_do_with_a_false_positive_in_stable
: _cell_select

D*a2015-12-17 08:12

7 楼

谢谢。我的基因只有coding sequence。会不会是转293T时候vortex把载体弄断了？会
产生这种问题吗？

【在 j******i 的大作中提到】

: 如果你的目的蛋白有polyA且没有反方向放的话在293T细胞里会得到大量的不完整的
: viral RNA 这种不完整的RNA即使能包装到病毒也是不能逆转录产生viral DNA的
:
: stable

D*a2015-12-17 08:12

8 楼

另外，我突发奇想，可不可以在hela细胞转染lentiviral载体和表达integrase的质粒
，是不是也能整合到基因组里面去？

j*i2015-12-17 08:12

9 楼

如果只有coding sequence的话应该用2A或者IRES链接puro 否则的话目的基因可能和
puro相互影响

【在 D***a 的大作中提到】

: 谢谢。我的基因只有coding sequence。会不会是转293T时候vortex把载体弄断了？会
: 产生这种问题吗？

D*a2015-12-17 08:12

10 楼

我用的是这个载体，能帮我看一下吗？加在bamHI和XhoI之间
http://www.addgene.org/39481/

【在 j******i 的大作中提到】

: 如果只有coding sequence的话应该用2A或者IRES链接puro 否则的话目的基因可能和
: puro相互影响

h*e2015-12-17 08:12

11 楼

你的puro是不是失效了？

j*i2015-12-17 08:12

12 楼

这个载体本身的设计非常糟糕能不用的话就不要用了我看了一下首先是缺了WPRE元
件再是用两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达可能会造成相互干扰

【在 D***a 的大作中提到】

: 我用的是这个载体，能帮我看一下吗？加在bamHI和XhoI之间
: http://www.addgene.org/39481/

D*a2015-12-17 08:12

13 楼

太感谢了。能推荐一个addgene的载体吗？

【在 j******i 的大作中提到】

: 这个载体本身的设计非常糟糕能不用的话就不要用了我看了一下首先是缺了WPRE元
: 件再是用两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达可能会造成相互干扰

j*i2015-12-17 08:12

14 楼

Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9，然后
把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。

【在 D***a 的大作中提到】

: 太感谢了。能推荐一个addgene的载体吗？

D*a2015-12-17 08:12

15 楼

太感谢了。手里有这个质粒。

【在 j******i 的大作中提到】

: Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9，然后
: 把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。

D*a2015-12-17 08:12

16 楼

再问一个，是不是要把我的基因的stop codon去掉？

【在 j******i 的大作中提到】

: Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9，然后
: 把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。

j*i2015-12-17 08:12

17 楼

是的

【在 D***a 的大作中提到】

: 再问一个，是不是要把我的基因的stop codon去掉？

j*x2015-12-17 08:12

18 楼

"两个启动子CMV和SV40来启动两个基因表达"这个问题不大，有些很成熟的商用载体也
是这么干的。我以前做过几个细胞系，不同的基因都表达的很正常。
慢病毒载体插入5kb的片段，包装效率很可能会比包装1kb以下的差出2个数量级以上。
但考虑到小基因的表达也很弱，应该是载体本身有存在系统系的问题，WPRE元件缺失应
该是可能性之一。只是好奇，设计载体的人居然连这点都没考虑到。

【在 j******i 的大作中提到】