Re: 各位都是用的哪个公司的Pfu Poly?# Biology - 生物学
g*m
1 楼
其实没必要控制cycle，虽然书上这么建议的。
俺先后用过两个proofreading，先是用NEB的Deep Vent,这个酶的忠实度狠好，俺用来构
建质粒，35cycles,将近1k的三个片段拿去测序，没有错误。
后来作RT PCR的时候因为template是total poly A RNA，而Deep Vent没有Hot start，结
果不是太consistant，有时候有，有时候没有，产率也偏低。俺就换到Pfx plantium
(Invitrogen)，号称市面上忠实度最高的，现在所有RT PCR都作出来了，35cycles,3K的
片段。先拿了一个基因的三个克隆测序，结果是在两端大致1.5k的长度上DNA序列有2-4个
错误，氨基酸序列没有错误。而且由于俺同时测了三个克隆，以后可以用没有错误的克隆
拼接成error free的一个全长片段。
总的来说，Mg的浓度不要太高，酶的用量要尽可能少，然后就是wait and pray了，呵和
。
好运！
俺先后用过两个proofreading，先是用NEB的Deep Vent,这个酶的忠实度狠好，俺用来构
建质粒，35cycles,将近1k的三个片段拿去测序，没有错误。
后来作RT PCR的时候因为template是total poly A RNA，而Deep Vent没有Hot start，结
果不是太consistant，有时候有，有时候没有，产率也偏低。俺就换到Pfx plantium
(Invitrogen)，号称市面上忠实度最高的，现在所有RT PCR都作出来了，35cycles,3K的
片段。先拿了一个基因的三个克隆测序，结果是在两端大致1.5k的长度上DNA序列有2-4个
错误，氨基酸序列没有错误。而且由于俺同时测了三个克隆，以后可以用没有错误的克隆
拼接成error free的一个全长片段。
总的来说，Mg的浓度不要太高，酶的用量要尽可能少，然后就是wait and pray了，呵和
。
好运！