再问基因克隆纯化蛋白后蛋白质分子量不对的问题。# Biology - 生物学c*u2010-07-01 07:071 楼正常的话15个工作日应该是三周,但是如果赶上中国的法定假日,比如十一和中秋的话,是不是check的时间会相应加长了?
j*a2010-07-01 07:072 楼谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解,有什么方法补救吗?背景:拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序,100 % 符合。(我的insert有1.0 kb),transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
c*u2010-07-01 07:073 楼顶!【在 c*******u 的大作中提到】: 正常的话15个工作日应该是三周,但是如果赶上中国的法定假日,比如十一和中秋的话: ,是不是check的时间会相应加长了?
g*y2010-07-01 07:074 楼不要只看你的insert 的基因序列,仔细看看你insert的基因前面有没有ATG. 如果有,可能翻译起始位点都不一样。 我有一次从别人那里拿了一个vector. 把我的基因插到mcs里,后来发现表达不对,再来查原基因,原来mcs之前还有一个signal peptide. 而且不在一个frame里,于是又作克隆去除那个signal peptide才搞对。
U*u2010-07-01 07:075 楼他们好像什么假都过吧?我们公司曾经找本州的议员发信给领事馆询问这种被check的事,虽然领事馆回信说这是正常手续,check不是在领事馆/大使馆,而在美国本土进行,但是很快就会有结果。他们说的15个工作日大概只是平均,运气好很快的。祝你好运。
g*y2010-07-01 07:076 楼还有你induce你的细胞之后,有没有直接看细胞 表达蛋白的mw? 如果是35kd,纯化后变成20kd那就是纯化过程中的问题了。His【在 j*****a 的大作中提到】: 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解,有什么: 方法补救吗?: 背景:拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序,100 % 符合。: (我的insert有1.0 kb),transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His: 柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
c*u2010-07-01 07:077 楼谢谢!【在 U***u 的大作中提到】: 他们好像什么假都过吧?: 我们公司曾经找本州的议员发信给领事馆询问这种被check的事,虽然领事馆回信说这: 是正常手续,check不是在领事馆/大使馆,而在美国本土进行,但是很快就会有结果。: 他们说的15个工作日大概只是平均,运气好很快的。: 祝你好运。
s*n2010-07-01 07:078 楼我觉得如果你的蛋白能够用Ni-NTA column纯化说明N端的His-tag没问题,很大可能是翻译提前终止或者降解了。如果是翻译提前终止的话,可能是稀有密码子的缘故,你可以试试一些带有稀有tRNA的菌株,如Rossetta系列,也可以直接合成codon optimized的基因。如果是降解的话需要分析一下是in vivo还是in vitro,in vivo很麻烦,可能要换菌株,in vitro的话可以在做cell lysis的时候加protease inhibitors.
k*u2010-07-01 07:0710 楼你要表达的是啥蛋白?His【在 j*****a 的大作中提到】: 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解,有什么: 方法补救吗?: 背景:拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序,100 % 符合。: (我的insert有1.0 kb),transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His: 柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
k*u2010-07-01 07:0712 楼看了下,这个蛋白做的挺多的,而且也不是膜蛋白。。。前面有个人都提到了,我觉得首先你要考虑目标基因的来源,如果和表达的系统差距比较大的话,先考虑codon variation的可能性。其次,如果C端有其它tag的话,可以直接破细胞检测下,看是不是表达中止。如果是降解的问题,试试看蛋白酶抑制剂,对于大肠杆菌,还可以试试看低温诱导,或者不用IPTG,还有其它诱导方式的。【在 j*****a 的大作中提到】: fructose bisphosphate aldolase