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再问基因克隆纯化蛋白后蛋白质分子量不对的问题。
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再问基因克隆纯化蛋白后蛋白质分子量不对的问题。# Biology - 生物学
c*u
1
正常的话15个工作日应该是三周,但是如果赶上中国的法定假日,比如十一和中秋的话
,是不是check的时间会相应加长了?
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j*a
2
谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解,有什么
方法补救吗?
背景:拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序,100 % 符合。
(我的insert有1.0 kb),transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.
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c*u
3
顶!

【在 c*******u 的大作中提到】
: 正常的话15个工作日应该是三周,但是如果赶上中国的法定假日,比如十一和中秋的话
: ,是不是check的时间会相应加长了?

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g*y
4
不要只看你的insert 的基因序列,仔细看看你insert的基因前面有没有ATG. 如果有,
可能翻译起始位点都不一样。 我有一次从别人那里拿了一个vector. 把我的基因插到
mcs里,后来发现表达不对,再来查原基因,原来mcs之前还有一个signal peptide. 而
且不在一个frame里,于是又作克隆去除那个signal peptide才搞对。
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U*u
5
他们好像什么假都过吧?
我们公司曾经找本州的议员发信给领事馆询问这种被check的事,虽然领事馆回信说这
是正常手续,check不是在领事馆/大使馆,而在美国本土进行,但是很快就会有结果。
他们说的15个工作日大概只是平均,运气好很快的。
祝你好运。
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g*y
6
还有你induce你的细胞之后,有没有直接看细胞 表达蛋白的mw? 如果是35kd,纯化后变
成20kd那就是纯化过程中的问题
了。

His

【在 j*****a 的大作中提到】
: 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解,有什么
: 方法补救吗?
: 背景:拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序,100 % 符合。
: (我的insert有1.0 kb),transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
: 柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.

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c*u
7
谢谢!

【在 U***u 的大作中提到】
: 他们好像什么假都过吧?
: 我们公司曾经找本州的议员发信给领事馆询问这种被check的事,虽然领事馆回信说这
: 是正常手续,check不是在领事馆/大使馆,而在美国本土进行,但是很快就会有结果。
: 他们说的15个工作日大概只是平均,运气好很快的。
: 祝你好运。

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s*n
8
我觉得如果你的蛋白能够用Ni-NTA column纯化说明N端的His-tag没问题,很大可能是
翻译提前终止或者降解了。如果是翻译提前终止的话,可能是稀有密码子的缘故,你可
以试试一些带有稀有tRNA的菌株,如Rossetta系列,也可以直接合成codon optimized
的基因。如果是降解的话需要分析一下是in vivo还是in vitro,in vivo很麻烦,可能
要换菌株,in vitro的话可以在做cell lysis的时候加protease inhibitors.
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j*3
9
是的,我去年被check时就遇上中秋节,前后一共20天,不光是工作日,全加在一起是
这么多天。
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k*u
10
你要表达的是啥蛋白?

His

【在 j*****a 的大作中提到】
: 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解,有什么
: 方法补救吗?
: 背景:拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序,100 % 符合。
: (我的insert有1.0 kb),transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
: 柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa.

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j*a
11
fructose bisphosphate aldolase
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k*u
12
看了下,这个蛋白做的挺多的,而且也不是膜蛋白。。。
前面有个人都提到了,我觉得首先你要考虑目标基因的来源,如果和
表达的系统差距比较大的话,先考虑codon variation的可能性。
其次,如果C端有其它tag的话,可以直接破细胞检测下,看是不是表达中止。
如果是降解的问题,试试看蛋白酶抑制剂,对于大肠杆菌,还可以试试看低温
诱导,或者不用IPTG,还有其它诱导方式的。

【在 j*****a 的大作中提到】
: fructose bisphosphate aldolase
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j*a
13
Thank you very much.
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