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siRNA做后用Trizol提取RNA
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siRNA做后用Trizol提取RNA# Biology - 生物学
G*i
1 楼
☆─────────────────────────────────────☆
cowboyzj (流浪的心) 于 (Thu May 21 19:40:36 2009) 提到:
金融工程,去年初开始工作,年底被laid off.本以为反正拿到了H1b,　找工作应该不是
大问题,　结果发现不到一年的工作经验实在是尴尬,　market里面太多太多candidate,
大部分工作都要求三年以上经验.　而且那时候正是金融风暴持续升级的时候,　偶尔
弄到一些面试却发现那些公司并没有诚心想招人.
就这样到了2009初,　发了些简历,　也是毫无反应.　于是就试了试其他的工作,　结果
幸运的拿到了一个小银行的financial data analyst的offer.　虽然不是我理想的工作
,　我还是庆幸在recession里能得到这个机会.　二月份坏消息传来,　tarp bank不能
招H1b...当时真是觉得美国把我的每个出路都堵死了.　三四月份我就处于很茫然的状
态,　基本没有申请工作,　每天就上网玩玩.
到了四月底突然醒过来,　发觉这样下去我永远找不到工作.　既然金融这么难找,　我
不
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d*g
2 楼
父母即将来美，想为父亲订一个轮椅服务，但担心会不会给海关官员留下不好印象，只
给父母很短的在美停留时间？请有经验的朋友说说。
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v*a
3 楼
第一次做siRNA，想请教大家，用Trizol提取了RNA后，在进入RT-PCR之前有什么
注意事项吗？比如说像overexpression后要用Dnase I处理（感谢上次艳阳天mm的帮助
）。谢谢啊！
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b*s
4 楼
过海关的时候不坐轮椅不就好了。

【在 d**********g 的大作中提到】
: 父母即将来美，想为父亲订一个轮椅服务，但担心会不会给海关官员留下不好印象，只
: 给父母很短的在美停留时间？请有经验的朋友说说。
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v*a
5 楼
在网上查了一下，貌似也要做Dnase I treatment，但想不通这是为什么呢

【在 v***a 的大作中提到】
: 第一次做siRNA，想请教大家，用Trizol提取了RNA后，在进入RT-PCR之前有什么
: 注意事项吗？比如说像overexpression后要用Dnase I处理（感谢上次艳阳天mm的帮助
: ）。谢谢啊！
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d*g
6 楼
嗯，过海关时不会坐着轮椅的，不过轮椅在后面跟着，好像也不大好。

【在 b****s 的大作中提到】
: 过海关的时候不坐轮椅不就好了。
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a*e
7 楼
for any RT-PCR, you need a DNaseI pre-treatment.
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s*x
8 楼
如果真的是身体状况需要，有什么好担心的？
如果只是为了转机偷懒可以自己不要动脑筋完全依赖别人
http://www.mitbbs.com/article_t2/Travel/31342061.html

【在 d**********g 的大作中提到】
: 父母即将来美，想为父亲订一个轮椅服务，但担心会不会给海关官员留下不好印象，只
: 给父母很短的在美停留时间？请有经验的朋友说说。
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v*a
9 楼
谢谢。以前只做从tissue中提取RNA，都没做过DNase I pre-treatment。出来的RT-PCR
的data倒是跟IB的吻合的。
不知道为什么in vitro了就不可以了呢？
还有，上次艳阳天mm说overexpression后做DNase I treatment是为了去除plasmid DNA
，想不通这个siRNA后是为了去除什么？谢谢。。。

【在 a***e 的大作中提到】
: for any RT-PCR, you need a DNaseI pre-treatment.
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x*i
10 楼
每次都给老爸定，没啥影响。不过我爸腿不好，拿拐棍，一看就需要轮椅的那种。
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h*g
11 楼
因为用Trizol或者说任何方法提RNA，都不能保证没有genomic DNA的contamination。所以要在RT前做一下 DNase I treatment
另外一个方法是，设计的引物要跨Intron，这样也可以避免genomic DNA 的contamination 的干扰.

PCR
DNA

【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢。以前只做从tissue中提取RNA，都没做过DNase I pre-treatment。出来的RT-PCR
: 的data倒是跟IB的吻合的。
: 不知道为什么in vitro了就不可以了呢？
: 还有，上次艳阳天mm说overexpression后做DNase I treatment是为了去除plasmid DNA
: ，想不通这个siRNA后是为了去除什么？谢谢。。。
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d*g
12 楼
我爸用拐棍好几年了，担心的是海关官员会认为他身体不好而只给很短的在美停留时间
。如果没啥影响，就太好了。如果不用轮椅，转机只有两个小时，我爸走得慢，怕时间
不够。
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v*a
13 楼
谢谢
那这么说我之前从tissue中提的没做DNase I treatment的result不太可靠喽？
设计引物我一般是在CDS区选，这样应该没问题吧

。所以要在RT前做一下 DNase I treatment
contamination 的干扰.

【在 h****g 的大作中提到】
: 因为用Trizol或者说任何方法提RNA，都不能保证没有genomic DNA的contamination。所以要在RT前做一下 DNase I treatment
: 另外一个方法是，设计的引物要跨Intron，这样也可以避免genomic DNA 的contamination 的干扰.
:
: PCR
: DNA
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n*n
14 楼
Don't worry about DNA. Because your control and KD sample have the same
treatment and you just compare them, it doesn't matter whether you do DNAase
treatment or mot.
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a*e
15 楼
No, it does matter.
The contamination of DNA in the RNA sample will mask the fold change
caused by RNAi.
For example, your RNA is 10 before treatment, but 1 after treatment. Thus
the fold change is 10.
However, if you have 5 part of DNA in your sample, the fold change 15/6 =
2.5 fold.

DNAase

【在 n****n 的大作中提到】
: Don't worry about DNA. Because your control and KD sample have the same
: treatment and you just compare them, it doesn't matter whether you do DNAase
: treatment or mot.
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f*r
16 楼
不用这么小心翼翼。
如果WB显示KD了50-80%，RNA应该没啥问题。跑一个RT-PCR看看就是了。如果KD水平没
有达到90%以上，再去考虑加DNase。
如果WB显示KD水平小于50%，甚至不足1/3，就不用琢磨RNA了。
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v*a
17 楼
thank you
pretty clear

【在 a***e 的大作中提到】
: No, it does matter.
: The contamination of DNA in the RNA sample will mask the fold change
: caused by RNAi.
: For example, your RNA is 10 before treatment, but 1 after treatment. Thus
: the fold change is 10.
: However, if you have 5 part of DNA in your sample, the fold change 15/6 =
: 2.5 fold.
:
: DNAase
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v*a
18 楼
谢谢！

【在 f*********r 的大作中提到】
: 不用这么小心翼翼。
: 如果WB显示KD了50-80%，RNA应该没啥问题。跑一个RT-PCR看看就是了。如果KD水平没
: 有达到90%以上，再去考虑加DNase。
: 如果WB显示KD水平小于50%，甚至不足1/3，就不用琢磨RNA了。
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c*n
19 楼
The easier way is to design a pair of primers at exon junctions so that the
PCR reaction won't pick up anything from genomic DNA.
You can certainly do DNase I treatment but often you lose a lot of RNA
during this step.

【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢
: 那这么说我之前从tissue中提的没做DNase I treatment的result不太可靠喽？
: 设计引物我一般是在CDS区选，这样应该没问题吧
:
: 。所以要在RT前做一下 DNase I treatment
: contamination 的干扰.
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y*i
20 楼
Dude, genomic DNA has only two copies/per cell.

Thus
=

【在 a***e 的大作中提到】
: No, it does matter.
: The contamination of DNA in the RNA sample will mask the fold change
: caused by RNAi.
: For example, your RNA is 10 before treatment, but 1 after treatment. Thus
: the fold change is 10.
: However, if you have 5 part of DNA in your sample, the fold change 15/6 =
: 2.5 fold.
:
: DNAase
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n*n
21 楼
Maybe you are right. But we do this so many times without DNAase treatment
and always get not bad results for Real-time PCR. So i think treatment with
DNAase or not is not big problem.

【在 a***e 的大作中提到】
: No, it does matter.
: The contamination of DNA in the RNA sample will mask the fold change
: caused by RNAi.
: For example, your RNA is 10 before treatment, but 1 after treatment. Thus
: the fold change is 10.
: However, if you have 5 part of DNA in your sample, the fold change 15/6 =
: 2.5 fold.
:
: DNAase
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h*n
22 楼
I run no-RT control.
I don't think DNase is REQUIRED.
avatar
a*e
23 楼
I agree that it may be not that important to treat RNA sample with DNaseI
during the RNA purification process in the original question. However, it is
better to maintain a "good habit" to do so.
There are several reasons for this:
(1) it doesn't add many extra work. DNaseI treatment is very simple and fast
. Qiagen has on-column DNaseI digestion kit. Or an extra TRIzol purification
step only adds one more hour.
(2) if the experiments include transfection of plasmid to overexpress some
genes or s
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n*k
24 楼
Mark! Baozi, Oncogene!

is
fast
purification
mentioned

【在 a***e 的大作中提到】
: I agree that it may be not that important to treat RNA sample with DNaseI
: during the RNA purification process in the original question. However, it is
: better to maintain a "good habit" to do so.
: There are several reasons for this:
: (1) it doesn't add many extra work. DNaseI treatment is very simple and fast
: . Qiagen has on-column DNaseI digestion kit. Or an extra TRIzol purification
: step only adds one more hour.
: (2) if the experiments include transfection of plasmid to overexpress some
: genes or s
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