how to trouble-shoot a mouse genotyping protocol - 未名空间MITBBS历史存档

how to trouble-shoot a mouse genotyping protocol# Biology - 生物学

f*32010-11-08 08:11

1 楼

最近看大家的贴也很有收获，深深觉得因材施教的重要。
其实身边的孩子里，是有真的神童的。所谓神是什么，我觉得不是背了几首诗，会了
几个字母这么简单，虽然神童记忆力肯定也不差。我见过的几个真的让我佩服的孩子，
一般是这样，第一，比较好奇和好强，喜欢迎难而上，耐心比较好；第二，解决问题
的时候，思路比较正确；第三，对抽象的东西很有兴趣，喜欢把具体的东西抽象化，然
后总结规律。这样的孩子，学什么都有兴趣，学什么都快，而且不学好不罢休。。。
为啥这么神，我觉得好像跟教法没有太大关系，因为我见过的这样的孩子里，放的也有
，抓的也有，有的父母真的不想让孩子学了，人家非要学，真是拦都拦不住。。。如果
说有共同点，可能一个是遗传好，一个是妈妈的脾气相对比较好。
上面这样的神童是最容易被羡慕的，也是家长们最希望的，这种孩子是想不早教都不可
能的 - 他们ready了啊，不教会不满意。可是更多的孩子就没特点么，应该不是，只
不过他们的特长不是那么明显，不是那么和当前的知识体系接轨。有“普通"孩子的父
母，更应该小心的教，不去死教那些孩子不感兴趣的东西来伤害孩子的特长，就说字母
，数字和说话这几个父母

G*o2010-11-08 08:11

2 楼

Visa Type：H1B
US Consulate Location: Beijing, China
Interviewed on 07/07/2014
Supporting material submitted on 07/16/2014
1st update 07/07/2014
2nd update 10/31/2014
issued 11/03/2014
-------------------------------FOR THOSE OF YOU WHO ARE STILL STRUGGLING----
------------------
Here are some probable methods to expedite administrative processing
(0) Visa Questionnaire by National Academy of Science
Fill out the form in the following url:
http://sites.nationalacademies.org/PGA/biso/visas/PGA_048197
SO FAR THIS IS PROVED TO BE THE MOST EFFECTIVE METHOD !
(1) Email:
Beijing Embassy: B************[email protected]
b*********[email protected]
(2) Tel:
Dept. of State: 1-202-485-7600 (press 1 then 0 to talk to an agent !)
Beijing US embassy: +86-010-56794700 (Press 1-2-2-0-5 to talk to an agent)
FBI National Name Check Program: 540-868-4399 ( this is used for criminal
background check)
FBI CJIS (Criminal Justice Information Service): 1-304-625-2000
--------------------------Hope this helps!----------------------------------
-----------------

w*e2010-11-08 08:11

3 楼

Here is the problem. We recently developed a mouse knockout line with a
company. The entire gene is knocked out with all the exons and introns
being replaced with a reporter gene (lacZ) cassette. We got the
heterozygous (+/-) mice and I did the breeding. But now I have trouble
genotyping to find out the knockout mice (-/-). I tried two pairs of
primers in that gene to PCR out ~400 bp fragments in the last exon (the
biggest exon which codes the functional domain of the protein). PCR with
one pair of primers didn't give any bands. The other PCR seemed worked
with a faint band at the predicted size for most of mice and no band for
about 1/4 of them (5 out of 16, which i assume is the correct Mendilian
ratio for the knockout). But because the bands were faint and there were
many non-specific bands, it didn't look very convincing to me. BTW, I did
use the touch-down PCR stategy to reduce non-specific amplification.
Because we are working on a brand new protein, there is no good antibody
against it. What are my options to confirm which ones are knockout mice? I
assume I could kill one or two and do RT-PCR to look at the mRNA or design
another pair of primers and hope it might give a clear-cut result. But if
there are other better options, I would love to know. PCR genotyping for
the reporter gene works fine. We just need a way to tell -/- from -/+,
both of which have the engineered reporter cassette. Thanks a lot!

G*e2010-11-08 08:11

4 楼

lz 写得很好。你家娃好学还有韧性的可能性也很大！

j*n2010-11-08 08:11

5 楼

thanks for sharing!

w*e2010-11-08 08:11

6 楼

我感觉用比较好的LACZ 引物就应该可以/
看看哪个文献上报道其他LACZ的KI老鼠，如果他们的引物能同时PCR出WT 和LACZ
不同的2个带，你就应该可以用（如果你的老鼠本身造的没问题）。
具体设计引物，估计你得咨询做TARGET VECTOR的哪个人

【在 w***e 的大作中提到】

: Here is the problem. We recently developed a mouse knockout line with a
: company. The entire gene is knocked out with all the exons and introns
: being replaced with a reporter gene (lacZ) cassette. We got the
: heterozygous (+/-) mice and I did the breeding. But now I have trouble
: genotyping to find out the knockout mice (-/-). I tried two pairs of
: primers in that gene to PCR out ~400 bp fragments in the last exon (the
: biggest exon which codes the functional domain of the protein). PCR with
: one pair of primers didn't give any bands. The other PCR seemed worked
: with a faint band at the predicted size for most of mice and no band for
: about 1/4 of them (5 out of 16, which i assume is the correct Mendilian

i*e2010-11-08 08:11

7 楼

读的懂自己的孩子是关键

c*d2010-11-08 08:11

8 楼

thanks!

w*e2010-11-08 08:11

9 楼

还有验证 GENOTYPING根本不需要 RT-PCR

【在 w***e 的大作中提到】

: Here is the problem. We recently developed a mouse knockout line with a
: company. The entire gene is knocked out with all the exons and introns
: being replaced with a reporter gene (lacZ) cassette. We got the
: heterozygous (+/-) mice and I did the breeding. But now I have trouble
: genotyping to find out the knockout mice (-/-). I tried two pairs of
: primers in that gene to PCR out ~400 bp fragments in the last exon (the
: biggest exon which codes the functional domain of the protein). PCR with
: one pair of primers didn't give any bands. The other PCR seemed worked
: with a faint band at the predicted size for most of mice and no band for
: about 1/4 of them (5 out of 16, which i assume is the correct Mendilian

m*r2010-11-08 08:11

10 楼

I'm ur fan now!

【在 f*******3 的大作中提到】

: 最近看大家的贴也很有收获，深深觉得因材施教的重要。
: 其实身边的孩子里，是有真的神童的。所谓神是什么，我觉得不是背了几首诗，会了
: 几个字母这么简单，虽然神童记忆力肯定也不差。我见过的几个真的让我佩服的孩子，
: 一般是这样，第一，比较好奇和好强，喜欢迎难而上，耐心比较好；第二，解决问题
: 的时候，思路比较正确；第三，对抽象的东西很有兴趣，喜欢把具体的东西抽象化，然
: 后总结规律。这样的孩子，学什么都有兴趣，学什么都快，而且不学好不罢休。。。
: 为啥这么神，我觉得好像跟教法没有太大关系，因为我见过的这样的孩子里，放的也有
: ，抓的也有，有的父母真的不想让孩子学了，人家非要学，真是拦都拦不住。。。如果
: 说有共同点，可能一个是遗传好，一个是妈妈的脾气相对比较好。
: 上面这样的神童是最容易被羡慕的，也是家长们最希望的，这种孩子是想不早教都不可

P*f2010-11-08 08:11

11 楼

太感谢了，被check了三个月

【在 G*********o 的大作中提到】

: Visa Type：H1B
: US Consulate Location: Beijing, China
: Interviewed on 07/07/2014
: Supporting material submitted on 07/16/2014
: 1st update 07/07/2014
: 2nd update 10/31/2014
: issued 11/03/2014
: -------------------------------FOR THOSE OF YOU WHO ARE STILL STRUGGLING----
: ------------------
: Here are some probable methods to expedite administrative processing

f*32010-11-08 08:11

12 楼

这是真的。所以我觉得另一个贴里一个妈妈提到的要和孩子有足够的交流是比教育方
法还重要的关键。你得知道孩子在想什么，真的了解他们才能有针对性。
我的工作忙起来是很可怕的，有的时候就觉得对不起孩子，没有能给她们足够的时间，
后来觉得其实是误区，尤其是孩子大一点了，时间的长度本身其实不是重点，而是和孩
子相处这段时间的质量和问题随时解决的态度，而且要make yourself available. 就
是说，你可以不陪她，但她需要你的时候你要能马上放下手里的东西认真对待 - 我发
现这个“马上”很关键，如果她叫你，你立刻出现，其实很短时间就解决了，而且她有
了这个你随时会来的信心，也不会那么nervous, 老是叫你，但如果你说，等一下，
我弄完xx就来，孩子感觉不是那么好，她其实会更多叫你，反而更烦。。。

【在 i**e 的大作中提到】

: 读的懂自己的孩子是关键

M*62010-11-08 08:11

13 楼

Thanks and mark

f*32010-11-08 08:11

14 楼

还有一个很逗的研究啊，说平均来说一般政治上很敏锐的人，特别善于管理人的人呢，
智商反而比较低。这个原因呢，主要是智商比较高，推理很强的人一般比较依靠
reasoning来解决问题，而且非常自信，而很多人与人之间的事是要模糊解决的，不是
那么1+1=2的，有的时候需要有一种同理心和耐心，这些呢，有时候会让那些很聪明的
人觉得frustrated, "这些人怎么这么笨”，于是放弃了努力。
所谓天生我才必有用，我坚信没有真的生下来就注定失败的孩子，只有把他们定义为失
败的父母。记得我看阿甘的时候就很感动，那才是妈妈应该做的。孩子聪明与否，某方
面的才能高低，我们没法选择，但可以确定的是他们都有一颗完全信任你爱你的心，也
都有一条属于他自己的路等着他走，孩子哪方面越弱，我们做父母的如果再像外人一样
嘲笑他，给他压力，他不是更没有信心了么。

【在 f*******3 的大作中提到】

: 最近看大家的贴也很有收获，深深觉得因材施教的重要。
: 其实身边的孩子里，是有真的神童的。所谓神是什么，我觉得不是背了几首诗，会了
: 几个字母这么简单，虽然神童记忆力肯定也不差。我见过的几个真的让我佩服的孩子，
: 一般是这样，第一，比较好奇和好强，喜欢迎难而上，耐心比较好；第二，解决问题
: 的时候，思路比较正确；第三，对抽象的东西很有兴趣，喜欢把具体的东西抽象化，然
: 后总结规律。这样的孩子，学什么都有兴趣，学什么都快，而且不学好不罢休。。。
: 为啥这么神，我觉得好像跟教法没有太大关系，因为我见过的这样的孩子里，放的也有
: ，抓的也有，有的父母真的不想让孩子学了，人家非要学，真是拦都拦不住。。。如果
: 说有共同点，可能一个是遗传好，一个是妈妈的脾气相对比较好。
: 上面这样的神童是最容易被羡慕的，也是家长们最希望的，这种孩子是想不早教都不可

l*o2010-11-08 08:11

15 楼

多谢分享！ mark

s*n2010-11-08 08:11

16 楼

乱世英雄都是聪明绝顶的人。

【在 f*******3 的大作中提到】

: 还有一个很逗的研究啊，说平均来说一般政治上很敏锐的人，特别善于管理人的人呢，
: 智商反而比较低。这个原因呢，主要是智商比较高，推理很强的人一般比较依靠
: reasoning来解决问题，而且非常自信，而很多人与人之间的事是要模糊解决的，不是
: 那么1+1=2的，有的时候需要有一种同理心和耐心，这些呢，有时候会让那些很聪明的
: 人觉得frustrated, "这些人怎么这么笨”，于是放弃了努力。
: 所谓天生我才必有用，我坚信没有真的生下来就注定失败的孩子，只有把他们定义为失
: 败的父母。记得我看阿甘的时候就很感动，那才是妈妈应该做的。孩子聪明与否，某方
: 面的才能高低，我们没法选择，但可以确定的是他们都有一颗完全信任你爱你的心，也
: 都有一条属于他自己的路等着他走，孩子哪方面越弱，我们做父母的如果再像外人一样
: 嘲笑他，给他压力，他不是更没有信心了么。

s*02010-11-08 08:11

17 楼

mark

g*s2010-11-08 08:11

18 楼

nod nod.

【在 i**e 的大作中提到】

: 读的懂自己的孩子是关键

f*e2010-11-08 08:11

19 楼

大榭！！！
我成都12/3 h1b 返签， checked.......我觉得VO听到第一句话就开始皱眉头要我开始
倒霉了。developing analytical test methods to be used for quality control of
drug product, providing analytical support for manufacturing...
是太高深了么。。。。哭！！！！
VO让我email resume , 我都没带。。。然后说3-4 weeks processing time
希望最近签的人少, 希望可以快些，可以回去过节。。。。

【在 G*********o 的大作中提到】

: Visa Type：H1B
: US Consulate Location: Beijing, China
: Interviewed on 07/07/2014
: Supporting material submitted on 07/16/2014
: 1st update 07/07/2014
: 2nd update 10/31/2014
: issued 11/03/2014
: -------------------------------FOR THOSE OF YOU WHO ARE STILL STRUGGLING----
: ------------------
: Here are some probable methods to expedite administrative processing

g*s2010-11-08 08:11

20 楼

这个我不完全赞同，不过我也很困惑。
我总希望孩子有问题的时候，先争取自己解决问题，而不是简单的说需要帮助。不过LD
说我这样做是我懒:( 不过也许我潜意识的懒虫作怪。

【在 f*******3 的大作中提到】

: 这是真的。所以我觉得另一个贴里一个妈妈提到的要和孩子有足够的交流是比教育方
: 法还重要的关键。你得知道孩子在想什么，真的了解他们才能有针对性。
: 我的工作忙起来是很可怕的，有的时候就觉得对不起孩子，没有能给她们足够的时间，
: 后来觉得其实是误区，尤其是孩子大一点了，时间的长度本身其实不是重点，而是和孩
: 子相处这段时间的质量和问题随时解决的态度，而且要make yourself available. 就
: 是说，你可以不陪她，但她需要你的时候你要能马上放下手里的东西认真对待 - 我发
: 现这个“马上”很关键，如果她叫你，你立刻出现，其实很短时间就解决了，而且她有
: 了这个你随时会来的信心，也不会那么nervous, 老是叫你，但如果你说，等一下，
: 我弄完xx就来，孩子感觉不是那么好，她其实会更多叫你，反而更烦。。。

y*d2010-11-08 08:11

21 楼

多谢，不过第一个questionnaire里说超过60天后才可以填，我才一周，是不是填了也
没用？

【在 G*********o 的大作中提到】

: Visa Type：H1B
: US Consulate Location: Beijing, China
: Interviewed on 07/07/2014
: Supporting material submitted on 07/16/2014
: 1st update 07/07/2014
: 2nd update 10/31/2014
: issued 11/03/2014
: -------------------------------FOR THOSE OF YOU WHO ARE STILL STRUGGLING----
: ------------------
: Here are some probable methods to expedite administrative processing

n*h2010-11-08 08:11

22 楼

克林顿的智商是145左右，就算大家都公认得二傻小布什的智商大概129左右，都比正常
人高。

【在 f*******3 的大作中提到】

: 还有一个很逗的研究啊，说平均来说一般政治上很敏锐的人，特别善于管理人的人呢，
: 智商反而比较低。这个原因呢，主要是智商比较高，推理很强的人一般比较依靠
: reasoning来解决问题，而且非常自信，而很多人与人之间的事是要模糊解决的，不是
: 那么1+1=2的，有的时候需要有一种同理心和耐心，这些呢，有时候会让那些很聪明的
: 人觉得frustrated, "这些人怎么这么笨”，于是放弃了努力。
: 所谓天生我才必有用，我坚信没有真的生下来就注定失败的孩子，只有把他们定义为失
: 败的父母。记得我看阿甘的时候就很感动，那才是妈妈应该做的。孩子聪明与否，某方
: 面的才能高低，我们没法选择，但可以确定的是他们都有一颗完全信任你爱你的心，也
: 都有一条属于他自己的路等着他走，孩子哪方面越弱，我们做父母的如果再像外人一样
: 嘲笑他，给他压力，他不是更没有信心了么。

l*r2010-11-08 08:11

23 楼

你可真是不杠难受啊。
fresh说的是一般情况，美国总统那是一般人吗？人家就能做到IQ，EQ双高呗。

【在 n********h 的大作中提到】

: 克林顿的智商是145左右，就算大家都公认得二傻小布什的智商大概129左右，都比正常
: 人高。

p*m2010-11-08 08:11

24 楼

人家这是真爱啊! 哈哈哈

【在 l*****r 的大作中提到】

: 你可真是不杠难受啊。
: fresh说的是一般情况，美国总统那是一般人吗？人家就能做到IQ，EQ双高呗。

n*y2010-11-08 08:11

25 楼

看了本文之后，赞同之余，倒是不得不同意这么养确乎不能叫放养