请教一下纠结的实验问题 - 未名空间MITBBS历史存档

请教一下纠结的实验问题# Biology - 生物学

s*j2010-12-19 08:12

1 楼

真的是没钱很难幸福的。想去个公园玩玩，要门票，想吃个雪糕也是要钱。想孝敬一下
父母，没钱买礼物，想给孩子买个玩具也没钱。
似乎没钱什么事也干不了，没钱想去吃一顿烤鱼也要考量一下，这种感觉很憋屈，一天
两天还好，时间一长真的很崩溃，一刻也不想再延续下去。
真的没钱谈精神真的是有点好笑，即便是出个门，也要考虑坐公交，不能坐地铁，因为
地铁太贵了，这样的生活能够自得其乐，恐怕是要有非常高尚的精神修养，或者素质修
养才能做到吧？

K*e2010-12-19 08:12

2 楼

1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
品之间加的量就有点不同了啊。
2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
这样最后打算把IP产物如果一半做
wb，一半做银染，岂不是分不准了。
4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
会降解的自然不需要加”。现在开始加
PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？

p*n2010-12-19 08:12

3 楼

没钱，日子是很难过的，但也不是绝对的，有钱内心不丰富一样的。

f*n2010-12-19 08:12

4 楼

搬个凳子过来看GGJJ们给王的男人分析分析.

m*52010-12-19 08:12

5 楼

1 resin 稀释后加，直接吸柱床密度都不一样当然不准

【在 K**********e 的大作中提到】

: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？

m*52010-12-19 08:12

6 楼

3，残液再离一次吸就干静了。。其次，你都不是用一种方法染，分得准不准和你的结
果没关系
4 加蛋白酶抑制剂混合物，个人不爱加pmsf 以前纯化时觉得对蛋白有毒性

【在 K**********e 的大作中提到】

: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？

s*y2010-12-19 08:12

7 楼

这个的确是不太准。所以我们实验室就很讨厌用这个来做定量试验，但是，一般来讲，
多放一些agarose, 达到agarose 过量的程度，这样多一些少一些就比较无所谓了。
要用特别处理过的枪头，那种low protein binding 的。
这个只能多做几次重复试验，最后取平均值
这么低的浓度不会有问题。醇类在细胞内部是天然存在的代谢产物

【在 K**********e 的大作中提到】

: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？

K*e2010-12-19 08:12

8 楼

谢谢上面各位的指点，呵呵

j*a2010-12-19 08:12

9 楼

要用特别处理过的枪头，那种low protein binding 的。

c*r2010-12-19 08:12

10 楼

1. 用Wide Orifice Pipet Tips
2，3. 推荐这个kit：http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=01010345
在column里做IP这样的话resin和elution是分开的。
4. 我一直用Pierce的抑制剂，自己配的也用过，好像区别不大。

【在 K**********e 的大作中提到】

: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？

e*s2010-12-19 08:12

11 楼

清洗Resin我一般都是用那种小的针头，用真空吸干，又快又干净。
不管怎么做IP定量的误差率应该都至少在30%左右。

【在 K**********e 的大作中提到】

: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？

z*a2010-12-19 08:12

12 楼

try Dynal magnetic beads
Dynal magnetic beads saved my IP life