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请教如何钓出这个蛋白?
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请教如何钓出这个蛋白?# Biology - 生物学
t*1
1
昨天运行了一下统计。
boodbug这人嘴是真脏,基本每贴都是脏字。厕所捞出来的一样。
等我做几个关键词频率图给大家看看。还在找软件。
要搞,就要确保一棍子打死,我时间也有限,有网友表示愿意出力,再次深表感谢,我
会联系你们。
要搞,就把本版一帮人的做派全贴出来给全世界看看。
创业辞职的
人家不用Java方案就跳出来污言秽语的。
比30万40万比学校出身的
用NFLX内推拉帮结派的
我说过,顺便做一个社会学实验。呵呵。
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s*e
2
我预期蛋白A(130kD)的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
抗体做western检测药物处理前后
的变化,结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是,有一个蛋白条带(70kD)的变化非
常明显。从分子量判断,这个条带
肯定不是蛋白A,很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
果我想鉴定蛋白X,请问有什么办
法?我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系,看
不到那个70kD分子量位置有蛋白变
化。
我知道这里高人多多,所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。
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t*1
3
其实,搞还是会搞的。
而且,一定要搞得全NFLX看得见。
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d*y
4
我以前有过类似经验、姑且介绍、
你的判断比较一厢情愿、药物处理后、很难说会发生什么、会有特定现象通过WB显现出
来。
如果你一定认为这是个有意思的现象、值得追究、
不妨、
切条带做MS鉴定、了解到底是什么东西、然后再谈其他、
其次、如果是个有意思的现象、抗体染色可以尝试、但之前可用GFP tag之类的作萤光
live imaging
药物处理前后比较、
古得拉客

【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A(130kD)的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化,结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是,有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断,这个条带
: 肯定不是蛋白A,很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X,请问有什么办
: 法?我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系,看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多,所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

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s*e
5
谢谢回复。
我也知道这个未知蛋白是不是真的有价值现在还很难说。我只是想试一下看看。
你说切条带是指从胶上切还是膜上切?如果是从胶上切的话,染色灵敏度不够看不到条
带。如果是从膜上切的话,我担心一抗,二抗附在条带上,MS很难鉴定。我对MS没有经
验,所以不知道我的担心是不是有道理。谢谢。
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p*p
6
从大量的细胞中提取总蛋白,用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS-PAGE,
coomassie 染色,在70k那里割胶,mass spec。

【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A(130kD)的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化,结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是,有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断,这个条带
: 肯定不是蛋白A,很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X,请问有什么办
: 法?我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系,看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多,所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

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s*y
7
有一个可能性是那个蛋白就是你想要的,只不过在处理后会表达出/或者被局部水解出
一个比较小的形式。
你可以试着用不同的protein A的抗体来看看,如果也能检测出那个带,应该就是了

【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A(130kD)的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化,结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是,有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断,这个条带
: 肯定不是蛋白A,很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X,请问有什么办
: 法?我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系,看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多,所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

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s*e
8
谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体,并未检测到70kD的条带,所以我觉得
70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。
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e*s
9
另一个抗体检测不出来也不一定表示就不是那个130kD的降解产物,取决于抗体的识别
位点。
50kD以下有没有明显的条带呢?

【在 s*******e 的大作中提到】
: 谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体,并未检测到70kD的条带,所以我觉得
: 70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。

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s*s
10
//nod, 简洁明快, 标准做法.

【在 p****p 的大作中提到】
: 从大量的细胞中提取总蛋白,用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS-PAGE,
: coomassie 染色,在70k那里割胶,mass spec。

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M*n
11
run 2D gel before mass spec

【在 s******s 的大作中提到】
: //nod, 简洁明快, 标准做法.
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s*s
12
个人觉得没啥必要, 都已经affinity purify过一遍了, 2D有点over了.
另外, SDS-PAGE work的蛋白2D不一定work

【在 M*****n 的大作中提到】
: run 2D gel before mass spec
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v*a
13
正被mass spec弄得有点晕
看了几篇paper也不太知所云
这个说得真是简洁 令人一目了然

【在 p****p 的大作中提到】
: 从大量的细胞中提取总蛋白,用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS-PAGE,
: coomassie 染色,在70k那里割胶,mass spec。

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l*y
14
make some informed guesses and screen gfp fusion strain libary

【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A(130kD)的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化,结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是,有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断,这个条带
: 肯定不是蛋白A,很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X,请问有什么办
: 法?我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系,看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多,所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

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c*y
15
打击一下楼主,呵呵,不会是hsp70吧
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s*e
16
呵呵,即使是hsp70也算是新发现,因为以前并没有报道这个药物可以诱导hsp70表达
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l*s
17
It seems that the x protein is unrelated to A, why don't you do a direct microarray
to study differential expressions than sticking on protein X?

【在 s*******e 的大作中提到】
: 谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体,并未检测到70kD的条带,所以我觉得
: 70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。

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t*p
18
一般这种情况不值得深究。一个药物处理之后,显著变化的蛋白和mRNA不计其数,只是
恰巧有一个被你的抗体识别了。
用这个蛋白A的抗体的抗原序列做个搜索,先看看有没有大约70kd的同源蛋白。

【在 s*******e 的大作中提到】
: 我预期蛋白A(130kD)的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化,结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是,有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断,这个条带
: 肯定不是蛋白A,很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X,请问有什么办
: 法?我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系,看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多,所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

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W*7
19
我认为IP不一定work,WB能识别,很多情况下IP不work。我曾经也想做过类似的东西,
合作人的建议是转膜然后,在膜上染色切带,测序。
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c*r
20
基本就是最好办法了。
除了Coomassie,也可以silver stain,更sensitive一点,也许可以cut得更准些。
但是我看其实这个追究的意义可能真的不大。不过想玩儿,就玩儿玩儿好了。

【在 p****p 的大作中提到】
: 从大量的细胞中提取总蛋白,用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS-PAGE,
: coomassie 染色,在70k那里割胶,mass spec。

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C*4
21
我以前做过western之后的膜上酶切,再做质谱。中间有去除一抗和二抗的步骤,效果
还可以。
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C*4
22
这篇文章,也许对你有帮助。
Luque-Garcia, J.L., Zhou, G., Spellman, D.S., Sun, T.T., and Neubert, T.A.
(2008). Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein
identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics 7, 308-314.

【在 C*4 的大作中提到】
: 我以前做过western之后的膜上酶切,再做质谱。中间有去除一抗和二抗的步骤,效果
: 还可以。

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b*n
23
哈哈,我也有同感,很可能是chaperone
取决于当初抗原怎么制备的

【在 c******y 的大作中提到】
: 打击一下楼主,呵呵,不会是hsp70吧
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h*u
24

T.A.
protein
This review might be helpful to you too.
Identification of Direct Protein Targets of Small Molecules
Brett Lomenick, Richard W. Olsen, and Jing Huang
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cb100294v?
prevSearch=&searchHistoryKey=

【在 C*4 的大作中提到】
: 这篇文章,也许对你有帮助。
: Luque-Garcia, J.L., Zhou, G., Spellman, D.S., Sun, T.T., and Neubert, T.A.
: (2008). Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein
: identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics 7, 308-314.

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