EMSA再次求教——0 protein也有”complex band"。。。# Biology - 生物学
w*e
1 楼
请大家帮忙看看附件:6个sample加了相同量的radiolabeled RNA aptamer,以及
0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein,RNA MW ~30kD,protein MW ~200kD,PI
~5.3。用的是6% PAGE gel,没调pH。
主要有两大问题:1. free RNA band(bottom bands)是smear,而且band intensity
非常
低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。
2. 如果只是这一点也就罢了,从RNA-protein complex band应该就能得到kD,可是
0protein
smaple就有两条band,杯具。。。
之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample,也都有两条band,所以
不是某一
个sample screw up;2. 怀疑protein-RNA complex没有入胶,改用4%gel(以前做过
staining,free protein 4% gel之下肯定能入胶),结果和附件基本一样。
上来请教一下:1. 小MW的free RNA的这种band pattern正常吗?能改进吗?2. 有人见
过0
protein sample有"complex band"的情况吗?我还是怀疑protein-RNA complex没入胶
,然后
free RNA somehow也有部分没有入胶,所以superimpose到一起。可是为什么会发生就
没有一点头
绪了。BTW我用同一批sample做过filter binding assay,结果很正常(0protein
background很小,signal随protein conc.而上升直到plateau)。
请牛人指点。多谢!
0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein,RNA MW ~30kD,protein MW ~200kD,PI
~5.3。用的是6% PAGE gel,没调pH。
主要有两大问题:1. free RNA band(bottom bands)是smear,而且band intensity
非常
低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。
2. 如果只是这一点也就罢了,从RNA-protein complex band应该就能得到kD,可是
0protein
smaple就有两条band,杯具。。。
之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample,也都有两条band,所以
不是某一
个sample screw up;2. 怀疑protein-RNA complex没有入胶,改用4%gel(以前做过
staining,free protein 4% gel之下肯定能入胶),结果和附件基本一样。
上来请教一下:1. 小MW的free RNA的这种band pattern正常吗?能改进吗?2. 有人见
过0
protein sample有"complex band"的情况吗?我还是怀疑protein-RNA complex没入胶
,然后
free RNA somehow也有部分没有入胶,所以superimpose到一起。可是为什么会发生就
没有一点头
绪了。BTW我用同一批sample做过filter binding assay,结果很正常(0protein
background很小,signal随protein conc.而上升直到plateau)。
请牛人指点。多谢!