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酶切片断是否不可测序?
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酶切片断是否不可测序?# Biology - 生物学
s*o
1
请问测序高手,
construct 经限制性酶切后 做胶回收 然后 酶切片断 可否测序??
课题需要,在construct里构建double sequence (~2.5kb)。测序遇到麻烦。
谢谢
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i*l
2
可以

【在 s***o 的大作中提到】
: 请问测序高手,
: construct 经限制性酶切后 做胶回收 然后 酶切片断 可否测序??
: 课题需要,在construct里构建double sequence (~2.5kb)。测序遇到麻烦。
: 谢谢

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k*l
3
理论上可以,但是难度比较大,主要是从胶里提取一般不纯,有agarose
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j*x
4
何难之有?PCR产物切胶回收测序没做过?

【在 k****l 的大作中提到】
: 理论上可以,但是难度比较大,主要是从胶里提取一般不纯,有agarose
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s*o
5

你是不是试过啊,
我学校测序中心问,技术员说以前也有尝试过,不知为什么测不出来。

【在 k****l 的大作中提到】
: 理论上可以,但是难度比较大,主要是从胶里提取一般不纯,有agarose
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c*r
6
extract一下,然后precipitate试试看

【在 s***o 的大作中提到】
:
: 你是不是试过啊,
: 我学校测序中心问,技术员说以前也有尝试过,不知为什么测不出来。

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s*o
7

I have been scratching my head and still couldn't understand why our core
facility said it was close to impossible.
In theory, there is nothing really tricky....

【在 c******r 的大作中提到】
: extract一下,然后precipitate试试看
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c*r
8
should be a routine procedure. Double check with them why they think it's
close to impossible.
btw, what's your experimental design? details

【在 s***o 的大作中提到】
:
: I have been scratching my head and still couldn't understand why our core
: facility said it was close to impossible.
: In theory, there is nothing really tricky....

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c*1
9
直接测序片段,要设计引物,这个就有不确定性。连到T-easy或者TOPO载体,用T7,很
方便。
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s*o
10
谢谢大家,和测序中心几个人交流后,
得到一个比较合理的解释:
酶切会影响得率,对非high copy的plasmid影响尤其严重。
而gel回收在融胶时候,会有DNA的变性和复性,有的序列可能形成不规则结构比如三链。
估计要把insert subclone到比如 T-easy里面了。
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j*x
11
没做过酶切回收测序,因为除非特殊情况(比如长重复序列)基本上没有这个需要。但
是PCR产物回收测序算是routine这没有什么疑问吧。你们测序中心给出的解释,类比一
下,个人觉得很牵强。我专门打电话给测序公司的技术支持,人家说没有任何问题,而
且常用的qiagen等胶回收试剂盒的说明上也写得很清楚,回收后的片断可直接用于测序
反应(参考试剂盒说明或主业)。
1. 胶回收自然会影响得率,一般损失在50%以上,但是只要你能保证回收后测序模板的
浓度(一般而言20-30ng/ul足够了),就没有问题,这应该是不难办到的。大不了酶切
体系做大一点,质粒多用一点而已。
2. 胶回收过程中DNA的变性复性没有那么夸张,如果是单链DNA有可能形成不规则结构
,双链除非特殊情况,还是很稳定的,你的酶切产物和一般的PCR产物没有本质的不同
,测序上自然也没有明显的差异。建议你问问他们是不是PCR产物胶回收测序也不能做
,如果是这样的话,那就没什么可说的了,建议你送公司测序吧,你们的测序中心不靠
谱。
不知道你们那里是什么情况,反正我们这里的测序中心就是垃圾。硬件倒是很好,2台
454,2台GA,还有好几台传统3730,但是基本就没能理想的运转过。二代测序就不说了
,自己人都不建议去那里做。普通测序需要送样者自己做大量的手工工作,质量也不稳
定,相比较送测序公司,价格上甚至都没有什么优势,纯粹的摆设。测试了2次之后就
彻底放弃了,还是送公司比较靠谱,下午6点前把样品放到楼下collection box里,第
二天一早9点测序结果就发到你邮箱里了,省心省力。

链。

【在 s***o 的大作中提到】
: 谢谢大家,和测序中心几个人交流后,
: 得到一个比较合理的解释:
: 酶切会影响得率,对非high copy的plasmid影响尤其严重。
: 而gel回收在融胶时候,会有DNA的变性和复性,有的序列可能形成不规则结构比如三链。
: 估计要把insert subclone到比如 T-easy里面了。

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s*o
12
谢谢兄弟了。
我的确要做长重复序列,plasmid也是又大又low copy的。测序中心说不能做是不敢保
证测出的效果;如果我们愿意,他们可以试着看,但是不关结果如何,一样要bill的。
接触的公司到是很干脆,做不出来不收钱。
可是,我要的是一个肯定的结果,花不花钱又关我什么事。
做不出来的话,浪费的是我的时间精力,带来的是老板对项目进展的不满。
最稳妥的方式,还是克隆到另外vector上,再测。项目才开始,不想有什么drama;记
得以前有个兄弟好像就是开始克隆不出来,2-3月不到就被老板叫去谈话了。

【在 j****x 的大作中提到】
: 没做过酶切回收测序,因为除非特殊情况(比如长重复序列)基本上没有这个需要。但
: 是PCR产物回收测序算是routine这没有什么疑问吧。你们测序中心给出的解释,类比一
: 下,个人觉得很牵强。我专门打电话给测序公司的技术支持,人家说没有任何问题,而
: 且常用的qiagen等胶回收试剂盒的说明上也写得很清楚,回收后的片断可直接用于测序
: 反应(参考试剂盒说明或主业)。
: 1. 胶回收自然会影响得率,一般损失在50%以上,但是只要你能保证回收后测序模板的
: 浓度(一般而言20-30ng/ul足够了),就没有问题,这应该是不难办到的。大不了酶切
: 体系做大一点,质粒多用一点而已。
: 2. 胶回收过程中DNA的变性复性没有那么夸张,如果是单链DNA有可能形成不规则结构
: ,双链除非特殊情况,还是很稳定的,你的酶切产物和一般的PCR产物没有本质的不同

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j*x
13
了解你的考虑和选择
我只是从原理上回答你原本的问题,回收片段测序没有任何问题,这也是公司会这么和
你表态的原因,而不是你们测序中心表现出的那样问题重重风险大大,也有可能误导后
人。
花钱不花钱确实没啥可考虑的,不过片段测不出的,构建到质粒上也同样可很可能测不
出,序列性质决定的。至于浪费时间精力什么的,克隆到载体上一样面临着未知的风险
,尤其对于重复序列而言,如果是我我不会让事情复杂化,至少,如果真的觉得这个结
果很重要的话,两条路并进。
祝好运了

【在 s***o 的大作中提到】
: 谢谢兄弟了。
: 我的确要做长重复序列,plasmid也是又大又low copy的。测序中心说不能做是不敢保
: 证测出的效果;如果我们愿意,他们可以试着看,但是不关结果如何,一样要bill的。
: 接触的公司到是很干脆,做不出来不收钱。
: 可是,我要的是一个肯定的结果,花不花钱又关我什么事。
: 做不出来的话,浪费的是我的时间精力,带来的是老板对项目进展的不满。
: 最稳妥的方式,还是克隆到另外vector上,再测。项目才开始,不想有什么drama;记
: 得以前有个兄弟好像就是开始克隆不出来,2-3月不到就被老板叫去谈话了。

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