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已经筛到的stable cell line怎么又不表达外源蛋白了？

已经筛到的stable cell line怎么又不表达外源蛋白了？# Biology - 生物学

f*92011-05-29 07:05

1 楼

小弟phd第4年快第5年了
已经proposal也通过了
但是现在遇到一件很烦心的事：老板做事太拖拉不给改文章
现在手里已经压了2篇文章了，第三篇正在弄
每次去找老板（老板美国人，已经快退休那种）
老板就说最近没时间改我文章然后把我支走
第一篇文章拖了大概一年了
才改了一遍。。第二篇文章根本就还没看
组里以前有个师姐
也是这么拖着
最后师姐天天找老板终于发了一篇文章才毕业
看着自己一天天这么拖着年龄也大了
专业又不是什么热门
有时候真不想读了
拿个master走人算了
但是一想有真心觉得可惜
这里各位老师们，老虎肉，levis大哥
给小弟一些建议把。。你们说我到底该不该完成这个phd阿？
小弟今天quit phd的表格都打出来了
哎

a*w2011-05-29 07:05

2 楼

除了那个1.5的手续费，还有其他的费用吗？
"Additional charges from the ATM network owner may apply."这句话到底是什么意思
是不是任何银行任何atm都可以取？
谢谢

f*g2011-05-29 07:05

3 楼

很清香，用的茉莉花茶。

s*t2011-05-29 07:05

4 楼

筛一个带tag外源蛋白的over expression stable cell line 用于纯化complex。
挑的colony在6孔板里做wb，有好几个阳性克隆。
我选了一个克隆，现在扩增到两个10cm 板了，再做wb，没有表达了（我wb没问题，有
阳性对照。）
一直都是加药的（puro）。
这是怎么回事啊？已经建好的stable cell line还会消失吗？

f*h2011-05-29 07:05

5 楼

给个deadline, 不该就直接投啊。文章一定要老板该才能投吗？

【在 f**********9 的大作中提到】

: 小弟phd第4年快第5年了
: 已经proposal也通过了
: 但是现在遇到一件很烦心的事：老板做事太拖拉不给改文章
: 现在手里已经压了2篇文章了，第三篇正在弄
: 每次去找老板（老板美国人，已经快退休那种）
: 老板就说最近没时间改我文章然后把我支走
: 第一篇文章拖了大概一年了
: 才改了一遍。。第二篇文章根本就还没看
: 组里以前有个师姐
: 也是这么拖着

L*A2011-05-29 07:05

6 楼

煮了这么多！

s*u2011-05-29 07:05

7 楼

大概筛了多久开始挑克隆？时间太短有太多假阳性，比如2-3周。

【在 s*********t 的大作中提到】

: 筛一个带tag外源蛋白的over expression stable cell line 用于纯化complex。
: 挑的colony在6孔板里做wb，有好几个阳性克隆。
: 我选了一个克隆，现在扩增到两个10cm 板了，再做wb，没有表达了（我wb没问题，有
: 阳性对照。）
: 一直都是加药的（puro）。
: 这是怎么回事啊？已经建好的stable cell line还会消失吗？

m*72011-05-29 07:05

8 楼

唉，patpat..你都读四年了，还是拿到PhD再走吧，不然太可惜了。还是每次跟老板
meet都提提文章的事，希望他能早点改吧。Bless!

c*p2011-05-29 07:05

9 楼

帅哥对茶叶蛋情有独钟哈

s*t2011-05-29 07:05

10 楼

汗，就是2周多点。细胞都死光了呀，只留下细胞团克隆了，我就挑了。
为什么会有假阳性啊？是说慢慢的，那些表达蛋白的细胞又会死掉吗？

【在 s******u 的大作中提到】

: 大概筛了多久开始挑克隆？时间太短有太多假阳性，比如2-3周。

f*92011-05-29 07:05

11 楼

如果自己投。。。感觉文字那些还是不过关阿

【在 f*******h 的大作中提到】

: 给个deadline, 不该就直接投啊。文章一定要老板该才能投吗？

f*g2011-05-29 07:05

12 楼

早上就吃一碗oat和两个茶鸡蛋了，
最多加一个橙子和一杯soy milk

【在 c***p 的大作中提到】

: 帅哥对茶叶蛋情有独钟哈

B*o2011-05-29 07:05

13 楼

你质粒转染前切成单链了么？如果没切过，质粒在整合到染色体上前会随机的断在某个
位置，如果正好在你的目标蛋白coding sequence里蛋白就挂了，所以是可能出现假阳
性的

【在 s*********t 的大作中提到】

: 汗，就是2周多点。细胞都死光了呀，只留下细胞团克隆了，我就挑了。
: 为什么会有假阳性啊？是说慢慢的，那些表达蛋白的细胞又会死掉吗？

f*92011-05-29 07:05

14 楼

我也觉得
但是这么拖下去太恶心了
当年师姐被拖了6年才走人

【在 m*****7 的大作中提到】

: 唉，patpat..你都读四年了，还是拿到PhD再走吧，不然太可惜了。还是每次跟老板
: meet都提提文章的事，希望他能早点改吧。Bless!

c*s2011-05-29 07:05

15 楼

茶叶蛋的蛋白比较好吃。

H*s2011-05-29 07:05

16 楼

对于puromycin抗性的克隆筛选来说，这种情况是非常普遍的。看看你的载体吧，如果
标靶基因和puromycin抗性是由不同的启动子驱动的，那么你运气不太好，需要多筛选
克隆。主要有两种解释：（1）lentiviral/retroviral载体介导的异源表达，很普遍的
一个现象是整合到基因组的序列被flanking genomic sequences灭活。具体怎么回事，
现在还不太好解释。（2）低表达或者是不表达的细胞outgrow表达标靶蛋白的细胞，所
以，几代以后，你基本上丧失标靶蛋白的表达。
有两个建议：
（1）。使用抗性基因和标靶基因被同一启动子驱动的载体。标靶基因和抗性基因中间
有IRES。这样，产生抗性的细胞系必然表达标靶蛋白。如果被flanking genomic
sequences灭活的话，细胞会死亡，因为抗性丢失。
（2）。如果筛选到合适的细胞系，在前面几代要多冻存细胞。这样在后面的实验中你
不会丢失辛辛苦苦得来的细胞系。

【在 s*********t 的大作中提到】

p*e2011-05-29 07:05

17 楼

science部分当然是老板把关。语言部分，你要是狠的下来，自己掏腰包找writing
consultant修改（虽然花钱找consultant一般是老板掏钱）。
话说回来，人心都是肉长的。先不要闹情绪。跟老板晓之以情，动之以理，慢慢磨。把
老头子哄开心了，对自己也有好处。读过Phd的人，谁没吃过几次亏，受过点苦。熬出
来就好了。

【在 f**********9 的大作中提到】

: 如果自己投。。。感觉文字那些还是不过关阿

y*82011-05-29 07:05

18 楼

去壳后漂亮的纹身图更好看。
这一大锅，要吃好多天了。
据说鸡蛋最好一人一天吃一只。

【在 f******g 的大作中提到】

: 早上就吃一碗oat和两个茶鸡蛋了，
: 最多加一个橙子和一杯soy milk

d*p2011-05-29 07:05

19 楼

3周以上才行吧?

g*d2011-05-29 07:05

20 楼

你要理解快退休的老头的心理
其实人家是怕挂他名，万一这篇文章被控misconduct，退休金就都泡汤了。
知道一位快退休的老头，七八年了就挂名发了一篇文章。
你应该委婉的主动提出，把他的名字去掉，自己发，看他同意不同意。
文法的事找学校的writing center给你免费改就是了。
他们可能每次tutor有时间限制，你多跑几次即可。

小弟phd第4年快第5年了
已经proposal也通过了
但是现在遇到一件很烦心的事：老板做事太拖拉不给改文章
现在手里已经压了2篇文章了，第三篇正在弄
每次去找老板（老板美国人，已经快退休那种）
老板就说最近没时间改我文章然后把我支走
第一篇文章拖了大概一年了
才改了一遍。。第二篇文章根本就还没看
组里以前有个师姐
也是这么拖着
最后师姐天天找老板终于发了一篇文章才毕业
看着自己一天天这么拖着年龄也大了
专业又不是什么热门
有时候真不想读了
拿个master走人算了
但是一想有真心觉得可惜
这里各位老师们，老虎肉，levis大哥
给小弟一些建议把。。你们说我到底该不该完成这个phd阿？
小弟今天quit phd的表格都打出来了
哎

【在 f**********9 的大作中提到】

c*p2011-05-29 07:05

21 楼

介个。。。不少了吧。。。

【在 f******g 的大作中提到】

: 早上就吃一碗oat和两个茶鸡蛋了，
: 最多加一个橙子和一杯soy milk

j*i2011-05-29 07:05

22 楼

It's not surprising that transgene is silenced after two weeks or longer
time. The reason could be inserted into heterochromatin, or methylation.
However, those colonies might still be resistant to puro because of high
density.

f*h2011-05-29 07:05

23 楼

文字就别指望老板了。。。自己找同学proof-read. 学校有免费的writing service,
或者自己花钱找人该。
我感觉老板没有帮你改文字的义务。帮你把关science就够了。

【在 f**********9 的大作中提到】

: 如果自己投。。。感觉文字那些还是不过关阿

h*s2011-05-29 07:05

24 楼

小心噎着。
小孩最爱吃了。记得小时候是5毛一个。

c*r2011-05-29 07:05

25 楼

你可以考虑换个策略，按照楼上的意见把你的文章写好，不再要求他改文章，就是要求
他作为通讯作者把文章寄出去。

【在 f**********9 的大作中提到】

D*12011-05-29 07:05

26 楼

chi!
and thanks!

【在 f******g 的大作中提到】

: 早上就吃一碗oat和两个茶鸡蛋了，
: 最多加一个橙子和一杯soy milk

f*92011-05-29 07:05

27 楼

谢谢各位好心的大哥大姐了
昨天我去找老板好好谈了下
老板答应尽量快点改
哎。。。
楼上建议找其他人改
老板还是不同意
估计他自己署名的文章不想外人动吧
但愿老人家能快点
真心谢谢各位宝贵建议了！！

【在 p*******e 的大作中提到】

: science部分当然是老板把关。语言部分，你要是狠的下来，自己掏腰包找writing
: consultant修改（虽然花钱找consultant一般是老板掏钱）。
: 话说回来，人心都是肉长的。先不要闹情绪。跟老板晓之以情，动之以理，慢慢磨。把
: 老头子哄开心了，对自己也有好处。读过Phd的人，谁没吃过几次亏，受过点苦。熬出
: 来就好了。