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为啥做overexpression却检测不到蛋白过量表达？

为啥做overexpression却检测不到蛋白过量表达？# Biology - 生物学

j*o2011-06-21 07:06

1 楼

“妈妈，我是从你的肚子里出来的么？”
“是啊”
“那妈妈是谁把我放进你的肚子里的啊？”
“。。。是爸爸啊，要不你怎么管他叫爸爸呢？”汗，总不能说是上帝吧。
“那妈妈，爸爸是怎么把我放进你肚子里的啊？”
“。。。。。。。长大了你就知道了。。。。”
“妈妈，你是从谁的肚子里出来的啊？”
“妈妈当然是从妈妈的妈妈的肚子里出来的啦，妈妈的妈妈是谁啊？”
“是姥姥，那爸爸是从谁的肚子里出来的啊？”
“你猜”
女儿忽闪着黑黝黝的大眼睛说“姥爷！”
这逻辑思维没救了～～～

i*n2011-06-21 07:06

2 楼

事业成功就会抛弃糟糠妻的星座：冠军（巨蟹座）、亚军（双鱼座）、季军（处女座）

d*n2011-06-21 07:06

3 楼

今天不知道怎么回事，iphone 4S 突然出现了很诡异的问题，点击某一位置，只会先出
现一个方框，比如点击clock，只会现在clock那个app四周出现一个方框，然后iphone
会自动念“clock”这个单词，然后要打开clock这个app，就得等到那个方框出现后，
再双击出来。
最痛苦的是，打电话时候，每个数字得按两遍才能出来。比如800，按8字，首先按8，
在8出现方框，然后iphone念“eight”，然后再按一下8，这时候8才会出来。。。。
还有另一个问题是，手指点住某一个位置后无法上下拉动，好像这个功能给disable掉
了。
这究竟是什么问题？有谁认识这个问题么？怎么解决？重启了后也没效，home键和锁键
同时按来reset也没效果。

v*a2011-06-21 07:06

4 楼

需要某蛋白激酶在我培养的细胞里过量表达，筛选plasmid constructs时测序是正确的
，不过大量培养后得到很多的DNA拿去测序，好像说质量不好，测序结果就没有太较真。
然后就transfect我培养的细胞，取得cell lysate做western blot，发现蛋白表达量对
照vector的control基本无变化。以前我也在相同的细胞里overexpress过一个蛋白，
work得都还好。我应该怎么做，才能用western blot看到蛋白表达量的变化呢？谢谢！

S*a2011-06-21 07:06

5 楼

hehe

【在 j******o 的大作中提到】

: “妈妈，我是从你的肚子里出来的么？”
: “是啊”
: “那妈妈是谁把我放进你的肚子里的啊？”
: “。。。是爸爸啊，要不你怎么管他叫爸爸呢？”汗，总不能说是上帝吧。
: “那妈妈，爸爸是怎么把我放进你肚子里的啊？”
: “。。。。。。。长大了你就知道了。。。。”
: “妈妈，你是从谁的肚子里出来的啊？”
: “妈妈当然是从妈妈的妈妈的肚子里出来的啦，妈妈的妈妈是谁啊？”
: “是姥姥，那爸爸是从谁的肚子里出来的啊？”
: “你猜”

l*h2011-06-21 07:06

6 楼

巨蟹座的同学要着急地跺脚了吧

w*g2011-06-21 07:06

7 楼

小米米不要慌张，　好象你的残疾人帮助功能不小心被打开了.
我等会儿测试一下.

今天不知道怎么回事，iphone 4S 突然出现了很诡异的问题，点击某一位置，只会先出
现一个方框，比如点击clock，只会现在clock那个app四周出现一个方框，然后iphone
会自动念“clock”这个单词，然后要打开clock这个app，就得等到那个方框出现后，
再双击出来。
最痛苦的是，打电话时候，每个数字得按两遍才能出来。比如800，按8字，首先按8，
在8出现方框，然后iphone念“eight”，然后再按一下8，这时候8才会出来。。。。
还有另一个问题是，手指点住某一个位置后无法上下拉动，好像这个功能给disable掉
了。
这究竟是什么问题？有谁认识这个问题么？怎么解决？重启了后也没效，home键和锁键
同时按来reset也没效果。

【在 d******n 的大作中提到】

: 今天不知道怎么回事，iphone 4S 突然出现了很诡异的问题，点击某一位置，只会先出
: 现一个方框，比如点击clock，只会现在clock那个app四周出现一个方框，然后iphone
: 会自动念“clock”这个单词，然后要打开clock这个app，就得等到那个方框出现后，
: 再双击出来。
: 最痛苦的是，打电话时候，每个数字得按两遍才能出来。比如800，按8字，首先按8，
: 在8出现方框，然后iphone念“eight”，然后再按一下8，这时候8才会出来。。。。
: 还有另一个问题是，手指点住某一个位置后无法上下拉动，好像这个功能给disable掉
: 了。
: 这究竟是什么问题？有谁认识这个问题么？怎么解决？重启了后也没效，home键和锁键
: 同时按来reset也没效果。

m*n2011-06-21 07:06

8 楼

重新转化，挑单克隆然后测序。如果你的插入序列是pcr来的话，测序需要设计primer
把插入序列的全场都测过。还有你用的细胞系内源表达此担保么？

f*y2011-06-21 07:06

9 楼

相当有逻辑！

H*y2011-06-21 07:06

10 楼

!!

事业成功就会抛弃糟糠妻的星座：冠军（巨蟹座）、亚军（双鱼座）、季军（处女座）

【在 i****n 的大作中提到】

: 事业成功就会抛弃糟糠妻的星座：冠军（巨蟹座）、亚军（双鱼座）、季军（处女座）

w*g2011-06-21 07:06

11 楼

的确, 你的VOICEOVER被打开了.
关掉去:setting-general-accessibility-voiceover
off.

iphone

【在 w*****g 的大作中提到】

: 小米米不要慌张，　好象你的残疾人帮助功能不小心被打开了.
: 我等会儿测试一下.
:
: 今天不知道怎么回事，iphone 4S 突然出现了很诡异的问题，点击某一位置，只会先出
: 现一个方框，比如点击clock，只会现在clock那个app四周出现一个方框，然后iphone
: 会自动念“clock”这个单词，然后要打开clock这个app，就得等到那个方框出现后，
: 再双击出来。
: 最痛苦的是，打电话时候，每个数字得按两遍才能出来。比如800，按8字，首先按8，
: 在8出现方框，然后iphone念“eight”，然后再按一下8，这时候8才会出来。。。。
: 还有另一个问题是，手指点住某一个位置后无法上下拉动，好像这个功能给disable掉

S*e2011-06-21 07:06

12 楼

个人几点想法：
1）confirm constructs 正确
2) 质粒最好纯度要高，至少不要太差
3）转化效率要高
如果蛋白较大，转染后即使有表达（比如检测tag), 但量不够，
这时用内源蛋白抗体检测时就不一定能看到差异,正如你所说的与control比没变化。
如果你的构建加tag了，就检测一下看是否已表达了，若已表达那就想办法提高转化效
率吧。
(另外还想到的是加inducible 的promoter诱导时间长一些，不知是不是可行，仅供参
考）

t*f2011-06-21 07:06

13 楼

哈哈

c*s2011-06-21 07:06

14 楼

同不解中。
不是說巨蟹最顧家的嗎？
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l*n2011-06-21 07:06

15 楼

mark

v*m2011-06-21 07:06

16 楼

现实和理想是有差距的，不是没有恋曲都有美好结局。
你的蛋白可能压根就表达后不稳定或不表达。

真。

【在 v***a 的大作中提到】

: 需要某蛋白激酶在我培养的细胞里过量表达，筛选plasmid constructs时测序是正确的
: ，不过大量培养后得到很多的DNA拿去测序，好像说质量不好，测序结果就没有太较真。
: 然后就transfect我培养的细胞，取得cell lysate做western blot，发现蛋白表达量对
: 照vector的control基本无变化。以前我也在相同的细胞里overexpress过一个蛋白，
: work得都还好。我应该怎么做，才能用western blot看到蛋白表达量的变化呢？谢谢！

p*i2011-06-21 07:06

17 楼

可爱

【在 j******o 的大作中提到】

d*n2011-06-21 07:06

18 楼

那个accessibility怎么进去？我打开general后，没法拉页面到下面的accessibility
。。。点住之后往上一划然后拉动页面的功能不见了。。。
谢谢

【在 w*****g 的大作中提到】

: 的确, 你的VOICEOVER被打开了.
: 关掉去:setting-general-accessibility-voiceover
: off.
:
: iphone

v*a2011-06-21 07:06

19 楼

昨天重新测序了，全对。不过stop codon “TAA”的最后一个“A”未测出来，这个应
该不要紧吧？我的细胞是primary cells，我把plasmid转染进细胞，进行transient
overexpression。

primer

【在 m*********n 的大作中提到】

: 重新转化，挑单克隆然后测序。如果你的插入序列是pcr来的话，测序需要设计primer
: 把插入序列的全场都测过。还有你用的细胞系内源表达此担保么？

w*g2011-06-21 07:06

20 楼

哎，　现在的小米米啊．　自己bing一下不就好了. 算个, 哥好人做到底.
to sroll, flick three fingers....
在这个条件下, 要用三个指头才能滑动.

accessibility

【在 d******n 的大作中提到】

: 那个accessibility怎么进去？我打开general后，没法拉页面到下面的accessibility
: 。。。点住之后往上一划然后拉动页面的功能不见了。。。
: 谢谢

v*a2011-06-21 07:06

21 楼

谢谢！
我的蛋白没有tag，就是用抗此蛋白激酶的抗体看表达。这个蛋白本身在basal level下
用抗体看WB都蛮清楚的，看不出来差异会和此有关吗？
重新测序全对（除去终止子最后一个未得到confirm），质粒的纯度还行，A260/A280是
1.746，A260是0.365 AU。
提高转化效率有哪些方法呢？

【在 S******e 的大作中提到】

: 个人几点想法：
: 1）confirm constructs 正确
: 2) 质粒最好纯度要高，至少不要太差
: 3）转化效率要高
: 如果蛋白较大，转染后即使有表达（比如检测tag), 但量不够，
: 这时用内源蛋白抗体检测时就不一定能看到差异,正如你所说的与control比没变化。
: 如果你的构建加tag了，就检测一下看是否已表达了，若已表达那就想办法提高转化效
: 率吧。
: (另外还想到的是加inducible 的promoter诱导时间长一些，不知是不是可行，仅供参
: 考）

d*n2011-06-21 07:06

22 楼

搞定了，原来要用三个finger一起点才能划动。
多谢多谢啊。

【在 w*****g 的大作中提到】

: 的确, 你的VOICEOVER被打开了.
: 关掉去:setting-general-accessibility-voiceover
: off.
:
: iphone

S*e2011-06-21 07:06

23 楼

当时我转的蛋白较大，检测tag可以看到表达，但用蛋白本身抗体检测就看不大出来差
异，说明表达量还不够高。
MCS后一般有stop condon, 所以你的stop condon 没测出来应该没大问题。
我做transfection的质粒一般A260/280 是大于等于1.9， Qiagen kit prep.
plasmid浓度最好1ug/ul 以上。
我觉得你看不到差异的原因很可能是表达量还不够，但你没有tag也没法检测它是否已
表达，你把效率提上去再检测看看，我觉得还是很有希望。
提高转化效率也是我一直的问题，但我估计我转的质粒比你大，我前几天在这问过这个
问题。你先用脂质体方法试两次，LTX或lip2000, 若还不行，建议你再try电转，据说
效率高出很多。

【在 v***a 的大作中提到】

: 谢谢！
: 我的蛋白没有tag，就是用抗此蛋白激酶的抗体看表达。这个蛋白本身在basal level下
: 用抗体看WB都蛮清楚的，看不出来差异会和此有关吗？
: 重新测序全对（除去终止子最后一个未得到confirm），质粒的纯度还行，A260/A280是
: 1.746，A260是0.365 AU。
: 提高转化效率有哪些方法呢？

d*n2011-06-21 07:06

24 楼

google到了，不过用的是你的关键词，多谢了哈

【在 w*****g 的大作中提到】

: 哎，　现在的小米米啊．　自己bing一下不就好了. 算个, 哥好人做到底.
: to sroll, flick three fingers....
: 在这个条件下, 要用三个指头才能滑动.
:
: accessibility

S*e2011-06-21 07:06

25 楼

另外，如果你的基因不是特别大，改用lentivirus，也是一个不错的选择。

w*g2011-06-21 07:06

26 楼

小米米奔一个吧. 我这个CALL CENTER阿三的角色也不能白扮演.

【在 d******n 的大作中提到】

: 搞定了，原来要用三个finger一起点才能划动。
: 多谢多谢啊。