r*y
2 楼
我现在需要把promoter和gene CDS克隆到一起。我先是分别克隆promoter and gene
CDS,然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
reverse primer做pcr,可是TA cloning后总不对,跑胶后看到合适大小的带也很弱,
我的pcr混合产物作了1:10 dilution。gene CDS is around 3.5 kb, promoter is 1.5
kb.是不是太长了?请指教!如果用gDNA序列太大了,以后也不好做。。。--
CDS,然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
reverse primer做pcr,可是TA cloning后总不对,跑胶后看到合适大小的带也很弱,
我的pcr混合产物作了1:10 dilution。gene CDS is around 3.5 kb, promoter is 1.5
kb.是不是太长了?请指教!如果用gDNA序列太大了,以后也不好做。。。--
C*e
4 楼
你这第二步的PCR产物大小对么?
如果promoter和gene之间你没有留overlapping region的话
不太能理解为什么这二步PCR应该work
“然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
reverse primer做pcr”
如果promoter和gene之间你没有留overlapping region的话
不太能理解为什么这二步PCR应该work
“然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
reverse primer做pcr”
r*y
6 楼
第二步不止一条条带,大小对的条带比较弱 还有你说的overlapping region是指的
primers,promoter reverse and gene forward prime有overlapping吗?是的话 大约
有10 bp overlapping oligos还是说这个overlapping region有其他的oligo代替?
thanks!【 在 Chamgrape (香槟葡萄) 的大作中提到: 】
primers,promoter reverse and gene forward prime有overlapping吗?是的话 大约
有10 bp overlapping oligos还是说这个overlapping region有其他的oligo代替?
thanks!【 在 Chamgrape (香槟葡萄) 的大作中提到: 】
C*e
7 楼
promoter reverse和gene forward吧
10bp overlap是不是有点太短了
相对于你两个片段来说(一个1.5kb一个3kb)
这个第二步PCR应该算是mega PCR吧
一般要摸条件优化的
很多时候前5个循环是不放promoter fwd primer和gene reverse primer的
等前几个循环产生足够多的full length template以后
再放两端的primer进去
如果第二步PCR你都不能确定有你要的终产物的话
做TA cloning出不来不奇怪啊
如果你确定有终产物的话
我建议是胶回收以后再做TA cloning
不然乱七八糟东西太多了
【在 r******y 的大作中提到】
: 第二步不止一条条带,大小对的条带比较弱 还有你说的overlapping region是指的
: primers,promoter reverse and gene forward prime有overlapping吗?是的话 大约
: 有10 bp overlapping oligos还是说这个overlapping region有其他的oligo代替?
: thanks!【 在 Chamgrape (香槟葡萄) 的大作中提到: 】
10bp overlap是不是有点太短了
相对于你两个片段来说(一个1.5kb一个3kb)
这个第二步PCR应该算是mega PCR吧
一般要摸条件优化的
很多时候前5个循环是不放promoter fwd primer和gene reverse primer的
等前几个循环产生足够多的full length template以后
再放两端的primer进去
如果第二步PCR你都不能确定有你要的终产物的话
做TA cloning出不来不奇怪啊
如果你确定有终产物的话
我建议是胶回收以后再做TA cloning
不然乱七八糟东西太多了
【在 r******y 的大作中提到】
: 第二步不止一条条带,大小对的条带比较弱 还有你说的overlapping region是指的
: primers,promoter reverse and gene forward prime有overlapping吗?是的话 大约
: 有10 bp overlapping oligos还是说这个overlapping region有其他的oligo代替?
: thanks!【 在 Chamgrape (香槟葡萄) 的大作中提到: 】
r*y
8 楼
好 谢谢 我是一开始什么都加进去了 我再试试按你说的前5不加primer先。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: promoter reverse和gene forward吧
: 10bp overlap是不是有点太短了
: 相对于你两个片段来说(一个1.5kb一个3kb)
: 这个第二步PCR应该算是mega PCR吧
: 一般要摸条件优化的
: 很多时候前5个循环是不放promoter fwd primer和gene reverse primer的
: 等前几个循环产生足够多的full length template以后
: 再放两端的primer进去
: 如果第二步PCR你都不能确定有你要的终产物的话
: 做TA cloning出不来不奇怪啊
【在 C*******e 的大作中提到】
: promoter reverse和gene forward吧
: 10bp overlap是不是有点太短了
: 相对于你两个片段来说(一个1.5kb一个3kb)
: 这个第二步PCR应该算是mega PCR吧
: 一般要摸条件优化的
: 很多时候前5个循环是不放promoter fwd primer和gene reverse primer的
: 等前几个循环产生足够多的full length template以后
: 再放两端的primer进去
: 如果第二步PCR你都不能确定有你要的终产物的话
: 做TA cloning出不来不奇怪啊
A*0
12 楼
try clontech "Infusion" kit :)
a little pricy, but you'll love it.
gene
.5
【在 r******y 的大作中提到】
: 我现在需要把promoter和gene CDS克隆到一起。我先是分别克隆promoter and gene
: CDS,然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
: reverse primer做pcr,可是TA cloning后总不对,跑胶后看到合适大小的带也很弱,
: 我的pcr混合产物作了1:10 dilution。gene CDS is around 3.5 kb, promoter is 1.5
: kb.是不是太长了?请指教!如果用gDNA序列太大了,以后也不好做。。。--
a little pricy, but you'll love it.
gene
.5
【在 r******y 的大作中提到】
: 我现在需要把promoter和gene CDS克隆到一起。我先是分别克隆promoter and gene
: CDS,然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
: reverse primer做pcr,可是TA cloning后总不对,跑胶后看到合适大小的带也很弱,
: 我的pcr混合产物作了1:10 dilution。gene CDS is around 3.5 kb, promoter is 1.5
: kb.是不是太长了?请指教!如果用gDNA序列太大了,以后也不好做。。。--
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