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质粒连接效率低的问题

质粒连接效率低的问题# Biology - 生物学

w*g2012-03-13 07:03

1 楼

they even has scheduled the four interview manager, and let me fill the all
the application forms. But just got the recruiter call: you are
overqualified, we have to cancel the position interview.
what's wrong? The HR made a mistake? how do I follow up?

S*42012-03-13 07:03

2 楼

人生变故我们也许无力阻止，但爱情选择，自己却是要负上一些责任，唯有自己看重自
我价值，拒绝被消耗，爱才能往滋养方向去。倘若遇到无底限的消耗，我们认赔杀出的
底限究竟何在？
开创星座：牡羊、巨蟹、天平、魔羯
当对方的「心已不在」，就是开创星座的底限了。倘若「感情还拉得回来」，念旧的开
创星座往往愿「再试一次看看」，毕竟感情走到这地步并不容易。但若感受不到关心与
爱，只有争执、隐瞒，或冷漠到连斥责都没有时，就是该「放下、放过自己」的时候了。
所以，是否到达底限，关键在开创星座自己「放不放得下」。只要还念着旧情、念着美
好回忆、念着「顾全大局」、舍不下「一起奋斗的局面」，自己就会被卡得动弹不得。
开创星座需要时间好「淡出」一段感情，因为无法狠心、绝决地切断，所以常因「还在
犹豫」而忍耐着不可思议的消耗，好比对方劈腿也愿死命硬撑，或金钱不断输出却不敢
抗议；这些「非常人能忍受」的事，还真被开创给忍下来，有的算撑到对方浪子回头，
但更多数是自己被消耗殆尽，才发现「大局无法靠一个人顾全」，承认世事已非。
观察自己的忍耐是否有价值吧，你们是有苦也不诉的爱面子一族，若不自救，谁也救不
了你。不要因为怕丢脸、怕失去安全感、怕离开舒适圈而勉强自己忍耐，若对方一再破
坏情份、伤你颜面、软土深掘，这等待就是毫无意义的，请勇敢做自己，你值得更好的
对象。
固定星座：金牛、狮子、天蝎、水瓶
首先，你得面对自己占有欲很强、可能有点霸道、太自我中心、可能不够贴心、凡事先
理所当然的事实，这些「自己不自觉的缺点」常导致感情不顺。固定星座过犹不及，不
是过度霸道，就是过度忍让，有拿捏中间值的困难。
不过固定星座有个「长处」，一旦固执起来是「八风吹不动」的，对自己想要的事物，
固定星座遇山凿山、遇水涉水，有墙挡前面不是跨、也不是绕，而是直接打穿再穿过去
，执念相当惊人。这样性格的固定星座，只要「还不觉得赔」，就会一直耗下去。而这
样的耗，与其说是在为对方付出，不如说是「满足自己的不想放弃」，受的人也未必领
情。
所以，「认不认赔」真的就在「一念之间」，被固执念头盘据时就算赔死、赔惨了也未
必自觉，还一心想「再做多一点看能不能感动对方」；但若伤到自尊，搞得自己「忽然
醒了」，忽然看懂「对方只是把自己当个屁」，并不珍惜自己的委屈与付出，一旦有了
这心念就忽然觉得自己很白痴，不想再继续搅和下去。
不管是觉得自己蠢而决定离开，还是深深伤了心而愿意放下，固定星座必然都付出了「
自己觉得很损失」的代价，也许是金钱、也许是青春，还有真心的爱，这也是为何，一
旦决定放弃，固定星座就完全不想回想，也不想再有任何牵扯的原因。
变动星座：双子、处女、射手、双鱼
在感情中，变动星座需要保有「自己仍是王子、公主」的幻想空间，这点很重要，浪漫
的幻想是爱情中的养分，足以让自己抵挡残酷的现实。变动星座可以为另一半做牛做马
，只要能感受「自己是对方生命中最重要的」，若感受不到就会「自己制造」，好比全
方位控制对方，占据对方生活，让人不知不觉过上「没自己不行」的日子，这也是一种
重要。被变动星座爱上，就像被全面包覆一般，被他的爱、关心、无所不在无所不管包
围，深深付出了才会有安全感，不再焦虑。
所以当「对方不受控」时，或「没把自己当回事」时，简直全面引爆变动星座的不安全
感，且深受打击，有些会启动「自欺机制」假装看不见，有些激烈性格的则导致疯狂，
有多爱就转成有多掌控的执念，忍不住要「高手过过招，拼个你死我活」，越在乎对方
、越气恨、过招的手段就越激烈变态，不能正面地爱那就负面地伤吧，都是一种「证明
自己有份量」的方式。
但这样的方式，往往也赔上自己的时间、声誉、曾有的爱跟恩情。其实变动星座只是渴
望成为另一半的「掌上明珠」，过上平静的日子，一点也不想成为变态啊。那么，一开
始就慎选「足够爱自己」，性格也不那么惊涛骇浪的对象，就真的很重要了。

B*n2012-03-13 07:03

3 楼

你的头像和我的很配

j*n2012-03-13 07:03

4 楼

用的Origene pCMV6-Entry的骨架
发现这个骨架本身用Zymo的z competent转化效率就特别低怀疑是低拷贝质粒
5ul质粒+50ulcompetent也只能长出十来个克隆
可是用这个骨架酶切后与目的基因PCR酶切产物做T4连接后更死活长不出克隆来
请问大家有啥建议？换competent？哪个公司的DH5a转化效率更好些？

k*a2012-03-13 07:03

5 楼

你可以试着写邮件给公司，表示你有多么适合这么职位blablabla，但是不用抱太大希
望，不妨try下
Good luck

all

【在 w*******g 的大作中提到】

: they even has scheduled the four interview manager, and let me fill the all
: the application forms. But just got the recruiter call: you are
: overqualified, we have to cancel the position interview.
: what's wrong? The HR made a mistake? how do I follow up?

M*s2012-03-13 07:03

6 楼

附转载id的不完全名单：
ailixisi(忧伤天使)
banjiajia(佳人有约)
beautiful007(旧梦空城)
bpbxd(奔跑兄弟)
caicaizizi(莫卷无声)
fding(奋斗)
fll(法拉利)
flycry(乞力马扎罗的雪)
fyyc(风韵犹存)
Georgegirl(天使之泪)
ggsddup(天天向上)
gnuannuan(暖暖)
ironmans(钢铁侠)
kaixin11(开心)
kehuan(yx)
kukumusic(酷酷世界音乐)
lbjn(兰博基尼)
LinQi(Link)
naicaisock(奶茶妹妹)
officegirl(云水谣)
pfsj(平凡世界)
pingguopai(苹果不懂安卓)
pingxie(吴邪家的张起灵)
RexHong(RexHong)
shuimohua11(水墨画)
ShuiRen004(陌上花开)
Sky1214(恋恋黄昏)
walkers(步行者)
wudiliangmei(无敌)
wumeiniang(我叫武媚娘)
xhnf(心花怒放)
xiaosansan(三儿)
XiaoT89757(唐七公子)
xrzs(心如止水)
zzw123(lhc)

T*e2012-03-13 07:03

7 楼

帮你转LA和Rainbow版了

Terabyte ！！！

【在 B*********n 的大作中提到】

: 你的头像和我的很配

b*n2012-03-13 07:03

8 楼

invitrogen
号称10^9
如果还不行就用电转吧，呜泱呜泱的一大片

【在 j******n 的大作中提到】

: 用的Origene pCMV6-Entry的骨架
: 发现这个骨架本身用Zymo的z competent转化效率就特别低怀疑是低拷贝质粒
: 5ul质粒+50ulcompetent也只能长出十来个克隆
: 可是用这个骨架酶切后与目的基因PCR酶切产物做T4连接后更死活长不出克隆来
: 请问大家有啥建议？换competent？哪个公司的DH5a转化效率更好些？

a*n2012-03-13 07:03

9 楼

难道之前没有电面么？直接让你on-site的？
如果这样，有可能HR觉得你合适，HM觉得你overqualify了

all

【在 w*******g 的大作中提到】

r*12012-03-13 07:03

10 楼

我说你最近你都没到版上来，原来去忙调查了，收获不少啊，呵呵。

【在 M********s 的大作中提到】

: 附转载id的不完全名单：
: ailixisi(忧伤天使)
: banjiajia(佳人有约)
: beautiful007(旧梦空城)
: bpbxd(奔跑兄弟)
: caicaizizi(莫卷无声)
: fding(奋斗)
: fll(法拉利)
: flycry(乞力马扎罗的雪)
: fyyc(风韵犹存)

B*n2012-03-13 07:03

11 楼

为啥。

【在 T*********e 的大作中提到】

: 帮你转LA和Rainbow版了
:
: Terabyte ！！！

r*d2012-03-13 07:03

12 楼

pEntry is a high copy number plasmid. I knew the person who constructed this
vector and had cloned a lot gene into it. I never had any problem. First,
what is the concentration of Kan for your plate, I usually use 20 to 30 mg/l
. Second, the volume of plasmid should be less than 5% of total volume of E.
coli. You can try the competent cell from bioline. For PCR ligation, if you
do a 12 degree over night ligation, the efficiency is better.

w*g2012-03-13 07:03

13 楼

HR did the phone interview ten days ago, this morning she called me and we
confirmed the on-site interview time, then the hr send me all the employment
related forms and let me fill. Ironically in the afternoon the same HR called
me and canceled it: I am MBA,with 5 years experience, and it is a financial
analyst position in a 1000 employees company.
How do I follow up?

V*l2012-03-13 07:03

14 楼

有人调查出来的．

【在 r****1 的大作中提到】

: 我说你最近你都没到版上来，原来去忙调查了，收获不少啊，呵呵。

T*e2012-03-13 07:03

15 楼

配个p啊，根本就是一个人
有说一个人跟他自己很配的吗？

【在 B*********n 的大作中提到】

: 你的头像和我的很配

j*n2012-03-13 07:03

16 楼

this
/l
E.
you
谢谢你的建议确实kan的浓度非常影响这个质粒我曾经用50ug/ml 一个克隆也出不来
后来按protocol降到25 就能出来十多个了我回头试试低温过夜看看

【在 r****d 的大作中提到】

: pEntry is a high copy number plasmid. I knew the person who constructed this
: vector and had cloned a lot gene into it. I never had any problem. First,
: what is the concentration of Kan for your plate, I usually use 20 to 30 mg/l
: . Second, the volume of plasmid should be less than 5% of total volume of E.
: coli. You can try the competent cell from bioline. For PCR ligation, if you
: do a 12 degree over night ligation, the efficiency is better.

w*g2012-03-13 07:03

17 楼

ding once

l*r2012-03-13 07:03

18 楼

开创星座真惨

了。

【在 S********4 的大作中提到】

: 人生变故我们也许无力阻止，但爱情选择，自己却是要负上一些责任，唯有自己看重自
: 我价值，拒绝被消耗，爱才能往滋养方向去。倘若遇到无底限的消耗，我们认赔杀出的
: 底限究竟何在？
: 开创星座：牡羊、巨蟹、天平、魔羯
: 当对方的「心已不在」，就是开创星座的底限了。倘若「感情还拉得回来」，念旧的开
: 创星座往往愿「再试一次看看」，毕竟感情走到这地步并不容易。但若感受不到关心与
: 爱，只有争执、隐瞒，或冷漠到连斥责都没有时，就是该「放下、放过自己」的时候了。
: 所以，是否到达底限，关键在开创星座自己「放不放得下」。只要还念着旧情、念着美
: 好回忆、念着「顾全大局」、舍不下「一起奋斗的局面」，自己就会被卡得动弹不得。
: 开创星座需要时间好「淡出」一段感情，因为无法狠心、绝决地切断，所以常因「还在

s*c2012-03-13 07:03

19 楼

You can try to follow up, but mostly likely they just already decided to
cancel the interview.