请教一个关于IRES的问题，急# Biology - 生物学
m*5
1 楼
请问IRES2(from clontech pIRES2)
前面如果有一个open的fit in kozak的ATG 并且没有stop coden，是否会抑制IRES
dependent的translation?
Thank you!!!
前面如果有一个open的fit in kozak的ATG 并且没有stop coden，是否会抑制IRES
dependent的translation?
Thank you!!!
s*y
2 楼
没有听说过这种说法。IRS 应该是靠local 结构识别的。
但是真的出现这个现象你也没辙。
【在 m******5 的大作中提到】
: 请问IRES2(from clontech pIRES2)
: 前面如果有一个open的fit in kozak的ATG 并且没有stop coden，是否会抑制IRES
: dependent的translation?
: Thank you!!!
但是真的出现这个现象你也没辙。
【在 m******5 的大作中提到】
: 请问IRES2(from clontech pIRES2)
: 前面如果有一个open的fit in kozak的ATG 并且没有stop coden，是否会抑制IRES
: dependent的translation?
: Thank you!!!
n*k
3 楼
IRES stands for Internal Ribo Entry Site if I don't remember wrong...well,
if it is completely in frame, I think you worry shouldn't be whether it
represses the IRES but a different protein being made...
【在 m******5 的大作中提到】
: 请问IRES2(from clontech pIRES2)
: 前面如果有一个open的fit in kozak的ATG 并且没有stop coden，是否会抑制IRES
: dependent的translation?
: Thank you!!!
if it is completely in frame, I think you worry shouldn't be whether it
represses the IRES but a different protein being made...
【在 m******5 的大作中提到】
: 请问IRES2(from clontech pIRES2)
: 前面如果有一个open的fit in kozak的ATG 并且没有stop coden，是否会抑制IRES
: dependent的translation?
: Thank you!!!
h*y
4 楼
搭车问假设有这样一个构造EF1a-gene X-IRES-DsRed, 理论上讲一个subpopulation的
DsRed荧光越高，那么gene X在这个subpopulation表达也就越高，是吧？
DsRed荧光越高，那么gene X在这个subpopulation表达也就越高，是吧？
n*k
5 楼
presumably yes, but you would have to consider half life etc etc etc....BTW,
which vector do you have and how EF1a works in general, what cells are you
working on? I would love to have this one; btw, do you have EF1a with 2A
other than IRES..
【在 h******y 的大作中提到】
: 搭车问假设有这样一个构造EF1a-gene X-IRES-DsRed, 理论上讲一个subpopulation的
: DsRed荧光越高，那么gene X在这个subpopulation表达也就越高，是吧？
which vector do you have and how EF1a works in general, what cells are you
working on? I would love to have this one; btw, do you have EF1a with 2A
other than IRES..
【在 h******y 的大作中提到】
: 搭车问假设有这样一个构造EF1a-gene X-IRES-DsRed, 理论上讲一个subpopulation的
: DsRed荧光越高，那么gene X在这个subpopulation表达也就越高，是吧？
h*y
6 楼
Thanks. It is a lentiviral construct made in house
EF1a is a strong promoter....slightly less than CMV though
we have been using it for primary human cells and established cancer cell
lines
no 2A as the linker
BTW,
you
【在 n********k 的大作中提到】
: presumably yes, but you would have to consider half life etc etc etc....BTW,
: which vector do you have and how EF1a works in general, what cells are you
: working on? I would love to have this one; btw, do you have EF1a with 2A
: other than IRES..
EF1a is a strong promoter....slightly less than CMV though
we have been using it for primary human cells and established cancer cell
lines
no 2A as the linker
BTW,
you
【在 n********k 的大作中提到】
: presumably yes, but you would have to consider half life etc etc etc....BTW,
: which vector do you have and how EF1a works in general, what cells are you
: working on? I would love to have this one; btw, do you have EF1a with 2A
: other than IRES..
n*k
7 楼
but CMV has a big silencing caveat for many type of cells, esp stem cells...
I am ditching cmv in all our current studies..BTW, I would definitely go for
2A if ever I want to go in vivo...
【在 h******y 的大作中提到】
: Thanks. It is a lentiviral construct made in house
: EF1a is a strong promoter....slightly less than CMV though
: we have been using it for primary human cells and established cancer cell
: lines
: no 2A as the linker
:
: BTW,
: you
I am ditching cmv in all our current studies..BTW, I would definitely go for
2A if ever I want to go in vivo...
【在 h******y 的大作中提到】
: Thanks. It is a lentiviral construct made in house
: EF1a is a strong promoter....slightly less than CMV though
: we have been using it for primary human cells and established cancer cell
: lines
: no 2A as the linker
:
: BTW,
: you
s*s
8 楼
right. EF1a is better than CMV
and 2A is better than IRES considering you can always get robust expression
of the later gene
..
for
【在 n********k 的大作中提到】
: but CMV has a big silencing caveat for many type of cells, esp stem cells...
: I am ditching cmv in all our current studies..BTW, I would definitely go for
: 2A if ever I want to go in vivo...
and 2A is better than IRES considering you can always get robust expression
of the later gene
..
for
【在 n********k 的大作中提到】
: but CMV has a big silencing caveat for many type of cells, esp stem cells...
: I am ditching cmv in all our current studies..BTW, I would definitely go for
: 2A if ever I want to go in vivo...
s*r
9 楼
除了CMV, 还有那些Promoter常用。
..
for
【在 n********k 的大作中提到】
: but CMV has a big silencing caveat for many type of cells, esp stem cells...
: I am ditching cmv in all our current studies..BTW, I would definitely go for
: 2A if ever I want to go in vivo...
..
for
【在 n********k 的大作中提到】
: but CMV has a big silencing caveat for many type of cells, esp stem cells...
: I am ditching cmv in all our current studies..BTW, I would definitely go for
: 2A if ever I want to go in vivo...
n*k
10 楼
purpose? I think EF1a is likely one of the best for stem cells...
【在 s******r 的大作中提到】
: 除了CMV, 还有那些Promoter常用。
:
: ..
: for
【在 s******r 的大作中提到】
: 除了CMV, 还有那些Promoter常用。
:
: ..
: for
n*k
11 楼
sounds you have many different vectors, right buddy?
expression
【在 s******s 的大作中提到】
: right. EF1a is better than CMV
: and 2A is better than IRES considering you can always get robust expression
: of the later gene
:
: ..
: for
expression
【在 s******s 的大作中提到】
: right. EF1a is better than CMV
: and 2A is better than IRES considering you can always get robust expression
: of the later gene
:
: ..
: for
s*r
12 楼
普通的cell Line中表达，不一定是stem cell，就是想知道有没有比较versatile的。
EF1a是个strong promoter，有没有不那么强的，表达低一点的。
【在 n********k 的大作中提到】
: purpose? I think EF1a is likely one of the best for stem cells...
EF1a是个strong promoter，有没有不那么强的，表达低一点的。
【在 n********k 的大作中提到】
: purpose? I think EF1a is likely one of the best for stem cells...
s*s
13 楼
we use invitrogen lentiviral gateway. We modified the system to be able
to insert promotor, gene to be expressed, and a tag at the same time. It's
super convinient if you do routinely express different genes (with different
tags) with different promotors at the same time. However, our system is
not published, and has come commercial complications. I guess it won't be
very difficult to set up a similar system in the lab, if you really want to
use lentivirus that much.
【在 n********k 的大作中提到】
: sounds you have many different vectors, right buddy?
:
: expression
to insert promotor, gene to be expressed, and a tag at the same time. It's
super convinient if you do routinely express different genes (with different
tags) with different promotors at the same time. However, our system is
not published, and has come commercial complications. I guess it won't be
very difficult to set up a similar system in the lab, if you really want to
use lentivirus that much.
【在 n********k 的大作中提到】
: sounds you have many different vectors, right buddy?
:
: expression
s*s
14 楼
pgk比较弱，或者ubiquitinC,这个更弱一点
【在 s******r 的大作中提到】
: 普通的cell Line中表达，不一定是stem cell，就是想知道有没有比较versatile的。
: EF1a是个strong promoter，有没有不那么强的，表达低一点的。
【在 s******r 的大作中提到】
: 普通的cell Line中表达，不一定是stem cell，就是想知道有没有比较versatile的。
: EF1a是个strong promoter，有没有不那么强的，表达低一点的。
n*k
15 楼
Tk and Sv40 should be fine for weak expression
【在 s******s 的大作中提到】
: pgk比较弱，或者ubiquitinC,这个更弱一点
【在 s******s 的大作中提到】
: pgk比较弱，或者ubiquitinC,这个更弱一点
u*d
16 楼
good！
【在 s******s 的大作中提到】
: pgk比较弱，或者ubiquitinC,这个更弱一点
【在 s******s 的大作中提到】
: pgk比较弱，或者ubiquitinC,这个更弱一点
l*1
17 楼
sunny 老大和 长木行 longwoodwalk 不熟吗 in 2008 or 09 ?
LZ please refer
同主题阅读：Re: 这样构建bac，可行不？
[版面:生物学][首篇作者：longwoodwalk] , 2011年06月04日23:37:27
[分页:1 ]
longwoodwalk
[ 2 ]
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: Re: 这样构建bac，可行不？
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jun 5 11:34:27 2011, 美东)
如果是这样的话，又多了一种可能性。在mRNA上，不是所有情况下第一个ATG
都是起始密码子。前后的序列，比如Kozak序列，才是决定mRNA从哪里开始翻
译的起始位点。我怀疑还有一种可能性，因为你们破坏了A本身的ATG，Cre放
在了20bp之后。有可能Cre自己的ATG不能作为kozak或类似序列，所以，不能
被核糖体视为一个ORF的start codon，所以不能表达你的Cre。再往后面的
ATG, 即使有可能被视做一个ORF的起始密码字，也会造成移码（66％可能性）
或表达不完全。算作第E种可能性吧。
最简单的办法就是，把Cre放在后面的外显子里，可以用2A或IRES表达一个完整
的Cre蛋白，如果你不喜欢融合蛋白的话。分析原因毕竟不是你自己的课题。
愿你好运。
----
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: Re: 这样构建bac，可行不？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 23:37:27 2011, 美东)
我看到你前面发过一个帖子，说看不到cre表达。我说说我的理解。不知道对不对。
1）你这个方法说不上把A本身的ATG破坏掉。也可以说你的Cre利用了A基因的ATG。理论
上这样设计没有问题。
2）Cre只有Stop codon，没有pA，也没有问题。因为基因转录时候mRNA拼接，后面会有
A基因自己的pA。
3）这个设计当然表达Cre自己，不会表达融合蛋白。即使核糖体见到Stop codon没有掉下
来，可能因为不可知的原因滑到了下一个ATG，表达了另一个蛋白，对Cre自己来
讲，也是一个单一的蛋白。
4）理论上只要Cre有一点表达，即使比较弱，你的Reporter总是能够给你一些信号的。但
因为你说没有任何信号，所以说明Cre根本就没有表达。
但是什么原因不表达呢？我能想到的有4种可能行
A) Cre有突变。但可能性不大。相信不表达的话，你首先会想到测序。这个应该
被你排除了。
B) 启动子不全。做为BAC，这种可能性有（如果基因横跨上百kb,或几百kb)，但
比较小。建议做最后考虑。
C) 在BAC里有NeoR或类似抗性基因。做完重组之后应该去掉，而没有去掉。所以
破坏基因表达。不过我想你老板应该已经把它拿掉了。
D) 你给的信息太少。我不知道你基因在染色体上的结构。我有一种猜测，你的
基因的ATG在第一个外显子里，并且第一个外显子很短。接下来是一个比
较长的内含子。如果是这种结构的基因，Transcription factor complex（
涉及多种 transcription factors) 横跨Exon1。也就是说，transcription
factor binding sites 在exon1的前面和后面都有。你在Exon1里插入了一段
很长的DNA，完全破坏了转录因子们形成一个complex，所以不能启动表达。
如果是这种结构，我建议你把Cre放在后面的外显子里。比如，第2，3个外
显子。
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31525247.html
NB: Thanks for abl member at
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31681167.html
13th floor gave above ID name as a hint for above Digging out forum
historical record/s.
>>回复]
[ 13 ]
发信人: abl (BCR-ABL), 信区: Biology
标 题: Re: 中国人搞生物创业的有哪些牛人？
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 18 13:29:20 2012, 美东)
看来这里屯里的人真多，难怪叫博士屯
人叫longwoodwalk,，你说对了名字才好让weisgone搜索仰慕么。。。
====
回复]
[ 2 ]
发信人: sunnyday (飞鱼), 信区: Biology
标 题: Re: 请教一个关于IRES的问题，急
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jun 17 17:19:37 2012, 美东)
没有听说过这种说法。IRS 应该是靠local 结构识别的。
但是真的出现这个现象你也没辙。
LZ please refer
同主题阅读：Re: 这样构建bac，可行不？
[版面:生物学][首篇作者：longwoodwalk] , 2011年06月04日23:37:27
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longwoodwalk
[ 2 ]
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: Re: 这样构建bac，可行不？
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jun 5 11:34:27 2011, 美东)
如果是这样的话，又多了一种可能性。在mRNA上，不是所有情况下第一个ATG
都是起始密码子。前后的序列，比如Kozak序列，才是决定mRNA从哪里开始翻
译的起始位点。我怀疑还有一种可能性，因为你们破坏了A本身的ATG，Cre放
在了20bp之后。有可能Cre自己的ATG不能作为kozak或类似序列，所以，不能
被核糖体视为一个ORF的start codon，所以不能表达你的Cre。再往后面的
ATG, 即使有可能被视做一个ORF的起始密码字，也会造成移码（66％可能性）
或表达不完全。算作第E种可能性吧。
最简单的办法就是，把Cre放在后面的外显子里，可以用2A或IRES表达一个完整
的Cre蛋白，如果你不喜欢融合蛋白的话。分析原因毕竟不是你自己的课题。
愿你好运。
----
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: Re: 这样构建bac，可行不？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 23:37:27 2011, 美东)
我看到你前面发过一个帖子，说看不到cre表达。我说说我的理解。不知道对不对。
1）你这个方法说不上把A本身的ATG破坏掉。也可以说你的Cre利用了A基因的ATG。理论
上这样设计没有问题。
2）Cre只有Stop codon，没有pA，也没有问题。因为基因转录时候mRNA拼接，后面会有
A基因自己的pA。
3）这个设计当然表达Cre自己，不会表达融合蛋白。即使核糖体见到Stop codon没有掉下
来，可能因为不可知的原因滑到了下一个ATG，表达了另一个蛋白，对Cre自己来
讲，也是一个单一的蛋白。
4）理论上只要Cre有一点表达，即使比较弱，你的Reporter总是能够给你一些信号的。但
因为你说没有任何信号，所以说明Cre根本就没有表达。
但是什么原因不表达呢？我能想到的有4种可能行
A) Cre有突变。但可能性不大。相信不表达的话，你首先会想到测序。这个应该
被你排除了。
B) 启动子不全。做为BAC，这种可能性有（如果基因横跨上百kb,或几百kb)，但
比较小。建议做最后考虑。
C) 在BAC里有NeoR或类似抗性基因。做完重组之后应该去掉，而没有去掉。所以
破坏基因表达。不过我想你老板应该已经把它拿掉了。
D) 你给的信息太少。我不知道你基因在染色体上的结构。我有一种猜测，你的
基因的ATG在第一个外显子里，并且第一个外显子很短。接下来是一个比
较长的内含子。如果是这种结构的基因，Transcription factor complex（
涉及多种 transcription factors) 横跨Exon1。也就是说，transcription
factor binding sites 在exon1的前面和后面都有。你在Exon1里插入了一段
很长的DNA，完全破坏了转录因子们形成一个complex，所以不能启动表达。
如果是这种结构，我建议你把Cre放在后面的外显子里。比如，第2，3个外
显子。
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31525247.html
NB: Thanks for abl member at
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31681167.html
13th floor gave above ID name as a hint for above Digging out forum
historical record/s.
>>回复]
[ 13 ]
发信人: abl (BCR-ABL), 信区: Biology
标 题: Re: 中国人搞生物创业的有哪些牛人？
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 18 13:29:20 2012, 美东)
看来这里屯里的人真多，难怪叫博士屯
人叫longwoodwalk,，你说对了名字才好让weisgone搜索仰慕么。。。
====
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[ 2 ]
发信人: sunnyday (飞鱼), 信区: Biology
标 题: Re: 请教一个关于IRES的问题，急
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jun 17 17:19:37 2012, 美东)
没有听说过这种说法。IRS 应该是靠local 结构识别的。
但是真的出现这个现象你也没辙。
l*1
18 楼
LZ
just try intra google mitbbs Bio/Medi
with key word
then can get almost you wanted
google link:
//www.google.com/search?ie=UTF-8%2F&oe=UTF-8%2F&q=longwoodwalk&btnG=Hae&as_
sitesearch=utu.fi#hl=no&sclient=psy-ab&q=longwoodwalk+site:www.mitbbs.com&oq
=longwoodwalk+site:www.mitbbs.com&aq=f&aqi=&aql=&gs_l=serp.12...1131.6182.0.
7587.20.19.0.0.0.0.494.2304.8j1j2j1j2.14.0...0.0.kJJyOJEghGE&pbx=1&bav=on.2,
or.r_gc.r_pw.r_qf.,cf.osb&fp=74f08c87a2d1d86d&biw=1138&bih=596
just try intra google mitbbs Bio/Medi
with key word
then can get almost you wanted
google link:
//www.google.com/search?ie=UTF-8%2F&oe=UTF-8%2F&q=longwoodwalk&btnG=Hae&as_
sitesearch=utu.fi#hl=no&sclient=psy-ab&q=longwoodwalk+site:www.mitbbs.com&oq
=longwoodwalk+site:www.mitbbs.com&aq=f&aqi=&aql=&gs_l=serp.12...1131.6182.0.
7587.20.19.0.0.0.0.494.2304.8j1j2j1j2.14.0...0.0.kJJyOJEghGE&pbx=1&bav=on.2,
or.r_gc.r_pw.r_qf.,cf.osb&fp=74f08c87a2d1d86d&biw=1138&bih=596
l*1
19 楼
推断
不会影响IRES dependent的translation
如果第一exon 比较短 后边有一个长的intron的话
if unlucky 建议你把Cre or similar target 放在后面的外显子里。比如，第2，3个
外显子。
【在 m******5 的大作中提到】
: 请问IRES2(from clontech pIRES2)
: 前面如果有一个open的fit in kozak的ATG 并且没有stop coden，是否会抑制IRES
: dependent的translation?
: Thank you!!!
不会影响IRES dependent的translation
如果第一exon 比较短 后边有一个长的intron的话
if unlucky 建议你把Cre or similar target 放在后面的外显子里。比如，第2，3个
外显子。
【在 m******5 的大作中提到】
: 请问IRES2(from clontech pIRES2)
: 前面如果有一个open的fit in kozak的ATG 并且没有stop coden，是否会抑制IRES
: dependent的translation?
: Thank you!!!
r*r
20 楼
IRES有兩種 一個有G另一個沒有G
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