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用anti-HA 做western 没有信号怎么回事？

用anti-HA 做western 没有信号怎么回事？# Biology - 生物学

e*y2012-07-14 07:07

1 楼

【以下文字转载自 JobMarket 讨论区】
发信人: eharmony (eharmony), 信区: JobMarket
标题: [Job Opportunity] Sr. Software Engineer
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Sep 17 02:32:03 2010, 美东)
公司就不多介绍了。请有意者发送简历至e***********[email protected]。工作经验少点也
没关
系，基本功够扎实就可以。当然要是工作经验多就更好。
Job Summary:
eHarmony is looking for a highly talented individual to join our Matching
Engineering team! Every day, eHarmony matches millions of people based on
deep
compatibility, built on decades of psychological research. Matching is the
core of
eHarmony, and

d*y2012-07-14 07:07

2 楼

3月初递了485和EAD的申请，4月27的FP,可是就在FP前一天又收到另一封USCIS的通知
让5月初再去FP，可是没仔细看，以为是发重复了，结果第一次打完指纹回来研究，发
现是略有不同，一个是 for 485, code 3, 后一个是 for 485/765 code2 and code 3.
就又赶回去再打一次，结果是 two index finger print 加照片。上网看看了，好像
只有 e-file 的EAD卡要求另打两个食指指纹的。我们是Paper file 的为什么还要？
有人有类似的情况吗？
求祝福，赶快收到EAD卡和绿卡！，好像最近进度又慢下来了。

b*82012-07-14 07:07

3 楼

最近买了Roche的 anti-HA-peroxidase (3F10)抗体做植物中的western，结果是白板，
是怎么回事？大家有人用过这个抗体吗，因为一抗本身就带了HRP，所以就不用二抗
了，不知道这种抗体是不是没有用一抗和二抗的灵敏？

d*y2012-07-14 07:07

4 楼

没人知道吗？看来唯一的解释是神奇的USCIS把照片搞丢了，只好再拍一次？

m*52012-07-14 07:07

5 楼

我也用这株抗体，凑合的

【在 b*********8 的大作中提到】

: 最近买了Roche的 anti-HA-peroxidase (3F10)抗体做植物中的western，结果是白板，
: 是怎么回事？大家有人用过这个抗体吗，因为一抗本身就带了HRP，所以就不用二抗
: 了，不知道这种抗体是不是没有用一抗和二抗的灵敏？

k*u2012-07-14 07:07

6 楼

没听说要另打指纹的。
bless

3.

【在 d*****y 的大作中提到】

: 没人知道吗？看来唯一的解释是神奇的USCIS把照片搞丢了，只好再拍一次？

d*u2012-07-14 07:07

7 楼

你确定你转基因植物里HA fusion蛋白表达吗

d*y2012-07-14 07:07

8 楼

真没有人有类似情况吗，唉。。。。真是中奖了

c*b2012-07-14 07:07

9 楼

我也是在植物中蛋白表达，用的一样得抗体，WB和IP都非常好用，我用的1：1000的浓
度，还可以重复回收用一次。
你是怎么表达得蛋白的，转基因还是瞬时表达？蛋白定位在哪里？用的positive
control是什么？

【在 b*********8 的大作中提到】

d*y2012-07-14 07:07

10 楼

发信人: karengu (蓝色黄昏), 信区: Immigration
标题: Re: 急问，EAD卡是否要另打指纹
发信站: BBS 未名空间站 (Thu May 13 23:29:50 2010, 美东)
没听说要另打指纹的。
bless
——————————————————————
谢谢！真是天天担心，睡觉都不踏实。以前是赶上H1-B要抽签，大着肚子天天着急，害
得我女儿生出来就是个急性子，好了现在有天天担心EAD怎么还不批。我看好多人打完
指纹就批了，我这个都快一个月了，连个update都没有，还那么奇怪要打两次，真是担
心啊。。。

m*n2012-07-14 07:07

11 楼

这种情况我们遇过，就是那批次出了问题
直接让他们送个新的就可以了

【在 b*********8 的大作中提到】

b*82012-07-14 07:07

12 楼

谢谢楼上几位的回复。我是在烟草中做的瞬时表达'都出表型了'所以肯定是表达的'都
让他们送过第二次抗体了,结果还是白板'都不知道怎么办了。不会这次还有问题吧？可
惜我没有阳性对照'那里可以弄到对照呀？不过转膜肯定没有问题的'marker都转过去了

a*82012-07-14 07:07

13 楼

This antibody is super good in our hand. We used 1:10000 dilution and still
get strong signal. A pos ctrl is a must have.
You may also want to confirm the second batch you got had different lot#
from the first one.

c*b2012-07-14 07:07

14 楼

我觉得你还是好好先做好western或者GFP观察，然后在FISU，那个比你做western难多
了。出现表型不是什么好事，应该是你agroinfiltration失败了。你看看这篇文章关于
agroinfiltration （Studying NB-LRR Immune Receptor Localization by
Agroinfiltration Transient Expression），里面提到了关于植物需要的适宜条件。
首先植物需要种在23－25度，打完植物需要放在22度左右光照12小时以上，持续光照有
利于表达。另外，这么大的蛋白不加P19几乎肯定不会表达。但是加P19的比例需要摸索
。菌种也很重要。如果你用GV3101或者C58C1应该没有问题。如果你用的LBA4404,那就
一般表达效率要低（在烟草中）。最好的是GV2260,我刚发帖去求了，我的一个HA
fusion蛋白也是表达很低（绝对不是抗体问题，positive control每次都work）。
你先找个postitive control，随便弄个GUS或者GFP来fuse一个HA都可以。你必须要有
positive control，no control no experiment。而且你的是大蛋白，转膜比较难，不
能完全用marker做一个衡量，有可能还要调整transfer buffer。你可以参考一下abcam
的western for beginner，里面都有。
最后你的蛋白在哪里定位也很重要,你应该先预测一下。如果是膜蛋白你最好enrich
membrane
fraction，如果是核蛋白要enrich nuclei，细胞质蛋白就很容易，一般都能看到，除
非表达量特
别低。植物的核蛋白如果是DNA结合的又更难了，提取液中加1％的SDS几乎是必须的。
如果是
膜蛋白上样不要加热（最多65度10 min）。
最后一个题外话，我知道很多例子都是GFP融合蛋白在植物里面表达比小tag的更好，之
所以很多人不能用GFP来表达是因为出现了mislocalization或者complement的时候失败
了。所以你这个例子gfp反而表达更少（没有表型）我表示怀疑。

【在 b*********8 的大作中提到】

: 谢谢楼上几位的回复。我是在烟草中做的瞬时表达'都出表型了'所以肯定是表达的'都
: 让他们送过第二次抗体了,结果还是白板'都不知道怎么办了。不会这次还有问题吧？可
: 惜我没有阳性对照'那里可以弄到对照呀？不过转膜肯定没有问题的'marker都转过去了

b*82012-07-14 07:07

15 楼

非常感谢centuribob的详细解答！
我用的菌株是GV3101，有的加了P19，有的没有加，并且在24， 48h 不同时间点取
的样，结果都没有信号。我的蛋白也属于 NB-LRR ，在48h 就能看到轻微的细胞死亡
表型，72-96h后更明显，所以应该是蛋白表达没有问题。
另外，我的蛋白根据预测应该是细胞质和细胞核都有的，不是很肯定，所以想用GFP看
定位，但没有信号，也没有细胞死亡的表型。不知道是不是由于蛋白太大的缘故。
请问centuribob能否把你的带HA的载体借我做对照？因为如果我自己做一个，我不确定
会不会work. 非常感谢！

【在 c********b 的大作中提到】

: 我觉得你还是好好先做好western或者GFP观察，然后在FISU，那个比你做western难多
: 了。出现表型不是什么好事，应该是你agroinfiltration失败了。你看看这篇文章关于
: agroinfiltration （Studying NB-LRR Immune Receptor Localization by
: Agroinfiltration Transient Expression），里面提到了关于植物需要的适宜条件。
: 首先植物需要种在23－25度，打完植物需要放在22度左右光照12小时以上，持续光照有
: 利于表达。另外，这么大的蛋白不加P19几乎肯定不会表达。但是加P19的比例需要摸索
: 。菌种也很重要。如果你用GV3101或者C58C1应该没有问题。如果你用的LBA4404,那就
: 一般表达效率要低（在烟草中）。最好的是GV2260,我刚发帖去求了，我的一个HA
: fusion蛋白也是表达很低（绝对不是抗体问题，positive control每次都work）。
: 你先找个postitive control，随便弄个GUS或者GFP来fuse一个HA都可以。你必须要有