求助: 270KD 蛋白的半干转PROTOCOL# Biology - 生物学
s*t
1 楼
最近实验室湿法系统有点问题,想试试半干转. 看很多评论说半干转不适合大分子蛋白,
有人说现在半干转问题不大,比较困惑,想问问大家有没有成功的PROTOCOL,我们的是
INVITROGEN仪器.
多谢.
有人说现在半干转问题不大,比较困惑,想问问大家有没有成功的PROTOCOL,我们的是
INVITROGEN仪器.
多谢.
b*s
2 楼
你还是借个湿的老老实实地做over night 30V吧。我们实验室就有半干转的，我的经验
是100kda以上的，胶热了变形了蛋白都不能完全转过去。
白,
【在 s*********t 的大作中提到】
: 最近实验室湿法系统有点问题,想试试半干转. 看很多评论说半干转不适合大分子蛋白,
: 有人说现在半干转问题不大,比较困惑,想问问大家有没有成功的PROTOCOL,我们的是
: INVITROGEN仪器.
: 多谢.
是100kda以上的，胶热了变形了蛋白都不能完全转过去。
白,
【在 s*********t 的大作中提到】
: 最近实验室湿法系统有点问题,想试试半干转. 看很多评论说半干转不适合大分子蛋白,
: 有人说现在半干转问题不大,比较困惑,想问问大家有没有成功的PROTOCOL,我们的是
: INVITROGEN仪器.
: 多谢.
n*w
3 楼
搭车问一下，最近在转差不多300kD的蛋白，用湿法转，
试了几个条件，
1. CAPS transfer buffer (10% MeOH), PVDF (precast gel), 400mA 1 hour. 结果是
ladder的top 4 bands 还留了相当一部分在胶上，胶也开始变形了，但是immunoblot还
是能出来不少蛋白。
2. 3 都是改变电流和时间，结果还是会有ladder在胶上。
4. tris/glycine transfer buffer, no MeOH, 转的时间差不多，Ladder也没有全都过
去，虽然也能image出来需要的蛋白，虽然有点弱。。。
版上有经验的建议是湿法30v转overnight?
试了几个条件，
1. CAPS transfer buffer (10% MeOH), PVDF (precast gel), 400mA 1 hour. 结果是
ladder的top 4 bands 还留了相当一部分在胶上，胶也开始变形了，但是immunoblot还
是能出来不少蛋白。
2. 3 都是改变电流和时间，结果还是会有ladder在胶上。
4. tris/glycine transfer buffer, no MeOH, 转的时间差不多，Ladder也没有全都过
去，虽然也能image出来需要的蛋白，虽然有点弱。。。
版上有经验的建议是湿法30v转overnight?
c*1
4 楼
用running buffer with 20% methanol当做transfer buffer, 30V O.N. 300kD的蛋白
都没问题。
都没问题。
a*a
5 楼
湿转260-270kd的蛋白没什么问题。。当然肯定会有不少蛋白还残留在胶上的，buffer
里面少加一点甲醇就是了。甲醇的作用之一是清除同蛋白结合的SDS， SDS多的话转膜
速度很快，不小心就转到膜后面的纸上了。
个人经验。。
里面少加一点甲醇就是了。甲醇的作用之一是清除同蛋白结合的SDS， SDS多的话转膜
速度很快，不小心就转到膜后面的纸上了。
个人经验。。
s*t
6 楼
多谢各位.
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