请推荐做重叠延伸PCR的高保真polymerase,谢谢!# Biology - 生物学g*e2013-02-14 08:021 楼版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗?你们都用啥polymerase? 高保真的我们用Phusion,感觉不是很好请推荐一款比较好用的吧。谢谢!
c*b2013-02-14 08:023 楼如果两端需要加A,我用Fidelitaq (USB),一般就用Advantage HD DNA polymerase(clontech)。基本没问题。【在 g*******e 的大作中提到】: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗?: 你们都用啥polymerase? 高保真的: 我们用Phusion,感觉不是很好: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢!
g*e2013-02-14 08:024 楼有试过三个片段一起延伸到一起吗?【在 H*******i 的大作中提到】: 我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题,还没遇到第二次PCR做不出来的。: 。
H*i2013-02-14 08:025 楼3个连起来有那么10多次吧(不成环,成环我就试过几次成功一次。),只有一次有一组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来,然后分成两步连的(那次是帮别人做的)最多做过5片段连接我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+,除了个别末端有重复序列的比较麻烦,其他没出过什么问题
g*e2013-02-14 08:027 楼谢谢你是两个两个的先overlap还是一股脑放到一起overlap?【在 H*******i 的大作中提到】: 3个连起来有那么10多次吧(不成环,成环我就试过几次成功一次。),只有一次有一: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来,然后分成两步连的(那次是: 帮别人做的): 最多做过5片段连接: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+,除了个别末端有重复序: 列的比较麻烦,其他没出过什么问题
H*i2013-02-14 08:028 楼上面写了啊,只有一次是全放一起(A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer)死活做不出来,最后两两连起来的,那次有一个片段开始PCR就不太正常。其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的条件都是primer F+R 0.5ul 10mM eachA,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的dntp 200 μM each5*HFbuffer 10ul5%DMSO60度退火(设计的是68度以上)
p*i2013-02-14 08:0210 楼pfu turbo【在 g*******e 的大作中提到】: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗?: 你们都用啥polymerase? 高保真的: 我们用Phusion,感觉不是很好: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢!
l*12013-02-14 08:0211 楼Mark!【在 H*******i 的大作中提到】: 上面写了啊,只有一次是全放一起(A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer)死活做不出来,最: 后两两连起来的,那次有一个片段开始PCR就不太正常。: 其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的: 条件都是: primer F+R 0.5ul 10mM each: A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的: dntp 200 μM each: 5*HFbuffer 10ul: 5%DMSO: 60度退火(设计的是68度以上)
g*e2013-02-14 08:0212 楼请问你的overlap的各片段一般都是多大?貌似小片段比较容易overlap上了大片段就比较困难了我们现在是1kb-2kb-1kb【在 H*******i 的大作中提到】: 3个连起来有那么10多次吧(不成环,成环我就试过几次成功一次。),只有一次有一: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来,然后分成两步连的(那次是: 帮别人做的): 最多做过5片段连接: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+,除了个别末端有重复序: 列的比较麻烦,其他没出过什么问题