请推荐做重叠延伸PCR的高保真polymerase，谢谢！# Biology - 生物学
g*e
1 楼
版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗？
你们都用啥polymerase? 高保真的
我们用Phusion，感觉不是很好
请推荐一款比较好用的吧。谢谢！
你们都用啥polymerase? 高保真的
我们用Phusion，感觉不是很好
请推荐一款比较好用的吧。谢谢！
H*i
2 楼
我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题，还没遇到第二次PCR做不出来的。
。
。
c*b
3 楼
如果两端需要加A，我用Fidelitaq （USB），一般就用Advantage HD DNA polymerase
（clontech）。
基本没问题。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗？
: 你们都用啥polymerase? 高保真的
: 我们用Phusion，感觉不是很好
: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢！
（clontech）。
基本没问题。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗？
: 你们都用啥polymerase? 高保真的
: 我们用Phusion，感觉不是很好
: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢！
g*e
4 楼
有试过三个片段一起延伸到一起吗？
【在 H*******i 的大作中提到】
: 我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题，还没遇到第二次PCR做不出来的。
: 。
【在 H*******i 的大作中提到】
: 我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题，还没遇到第二次PCR做不出来的。
: 。
H*i
5 楼
3个连起来有那么10多次吧（不成环，成环我就试过几次成功一次。），只有一次有一
组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
帮别人做的）
最多做过5片段连接
我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
列的比较麻烦，其他没出过什么问题
组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
帮别人做的）
最多做过5片段连接
我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
列的比较麻烦，其他没出过什么问题
h*l
6 楼
NEB 有个比phusion 更新的，叫Q5. 可以要一点sample。。。
g*e
7 楼
谢谢
你是两个两个的先overlap还是一股脑放到一起overlap?
【在 H*******i 的大作中提到】
: 3个连起来有那么10多次吧（不成环，成环我就试过几次成功一次。），只有一次有一
: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
: 帮别人做的）
: 最多做过5片段连接
: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
: 列的比较麻烦，其他没出过什么问题
你是两个两个的先overlap还是一股脑放到一起overlap?
【在 H*******i 的大作中提到】
: 3个连起来有那么10多次吧（不成环，成环我就试过几次成功一次。），只有一次有一
: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
: 帮别人做的）
: 最多做过5片段连接
: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
: 列的比较麻烦，其他没出过什么问题
H*i
8 楼
上面写了啊，只有一次是全放一起（A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer）死活做不出来，最
后两两连起来的，那次有一个片段开始PCR就不太正常。
其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
条件都是
primer F+R 0.5ul 10mM each
A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
dntp 200 μM each
5*HFbuffer 10ul
5%DMSO
60度退火（设计的是68度以上）
后两两连起来的，那次有一个片段开始PCR就不太正常。
其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
条件都是
primer F+R 0.5ul 10mM each
A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
dntp 200 μM each
5*HFbuffer 10ul
5%DMSO
60度退火（设计的是68度以上）
g*e
9 楼
谢了谢了！！！
非常感谢
再试一下去
非常感谢
再试一下去
p*i
10 楼
pfu turbo
【在 g*******e 的大作中提到】
: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗？
: 你们都用啥polymerase? 高保真的
: 我们用Phusion，感觉不是很好
: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢！
【在 g*******e 的大作中提到】
: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗？
: 你们都用啥polymerase? 高保真的
: 我们用Phusion，感觉不是很好
: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢！
l*1
11 楼
Mark!
【在 H*******i 的大作中提到】
: 上面写了啊，只有一次是全放一起（A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer）死活做不出来，最
: 后两两连起来的，那次有一个片段开始PCR就不太正常。
: 其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
: 条件都是
: primer F+R 0.5ul 10mM each
: A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
: dntp 200 μM each
: 5*HFbuffer 10ul
: 5%DMSO
: 60度退火（设计的是68度以上）
【在 H*******i 的大作中提到】
: 上面写了啊，只有一次是全放一起（A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer）死活做不出来，最
: 后两两连起来的，那次有一个片段开始PCR就不太正常。
: 其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
: 条件都是
: primer F+R 0.5ul 10mM each
: A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
: dntp 200 μM each
: 5*HFbuffer 10ul
: 5%DMSO
: 60度退火（设计的是68度以上）
g*e
12 楼
请问你的overlap的各片段一般都是多大？
貌似小片段比较容易overlap
上了大片段就比较困难了
我们现在是1kb-2kb-1kb
【在 H*******i 的大作中提到】
: 3个连起来有那么10多次吧（不成环，成环我就试过几次成功一次。），只有一次有一
: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
: 帮别人做的）
: 最多做过5片段连接
: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
: 列的比较麻烦，其他没出过什么问题
貌似小片段比较容易overlap
上了大片段就比较困难了
我们现在是1kb-2kb-1kb
【在 H*******i 的大作中提到】
: 3个连起来有那么10多次吧（不成环，成环我就试过几次成功一次。），只有一次有一
: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
: 帮别人做的）
: 最多做过5片段连接
: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
: 列的比较麻烦，其他没出过什么问题
n*w
13 楼
我以前做4个片段overlap, a, b, c, d,
a的d的量正常加，但是b和c是加倍加，然后用phusion，work。
a的d的量正常加，但是b和c是加倍加，然后用phusion，work。
H*i
14 楼
我映像里没弄过几个都比较大的，一般就是promoter+cds+tag或者+几个spacer（最大
一般1K左右）
最终产物一般都是2K-3K左右
一般1K左右）
最终产物一般都是2K-3K左右
g*5
15 楼
co mark
【在 l**********1 的大作中提到】
: Mark!
【在 l**********1 的大作中提到】
: Mark!
m*m
16 楼
mark
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