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请推荐做重叠延伸PCR的高保真polymerase,谢谢!
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请推荐做重叠延伸PCR的高保真polymerase,谢谢!# Biology - 生物学
g*e
1
版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗?
你们都用啥polymerase? 高保真的
我们用Phusion,感觉不是很好
请推荐一款比较好用的吧。谢谢!
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H*i
2
我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题,还没遇到第二次PCR做不出来的。
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c*b
3
如果两端需要加A,我用Fidelitaq (USB),一般就用Advantage HD DNA polymerase
(clontech)。
基本没问题。

【在 g*******e 的大作中提到】
: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗?
: 你们都用啥polymerase? 高保真的
: 我们用Phusion,感觉不是很好
: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢!

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g*e
4
有试过三个片段一起延伸到一起吗?

【在 H*******i 的大作中提到】
: 我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题,还没遇到第二次PCR做不出来的。
: 。

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H*i
5
3个连起来有那么10多次吧(不成环,成环我就试过几次成功一次。),只有一次有一
组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来,然后分成两步连的(那次是
帮别人做的)
最多做过5片段连接
我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+,除了个别末端有重复序
列的比较麻烦,其他没出过什么问题
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h*l
6
NEB 有个比phusion 更新的,叫Q5. 可以要一点sample。。。
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g*e
7
谢谢
你是两个两个的先overlap还是一股脑放到一起overlap?

【在 H*******i 的大作中提到】
: 3个连起来有那么10多次吧(不成环,成环我就试过几次成功一次。),只有一次有一
: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来,然后分成两步连的(那次是
: 帮别人做的)
: 最多做过5片段连接
: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+,除了个别末端有重复序
: 列的比较麻烦,其他没出过什么问题

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H*i
8
上面写了啊,只有一次是全放一起(A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer)死活做不出来,最
后两两连起来的,那次有一个片段开始PCR就不太正常。
其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
条件都是
primer F+R 0.5ul 10mM each
A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
dntp 200 μM each
5*HFbuffer 10ul
5%DMSO
60度退火(设计的是68度以上)
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g*e
9
谢了谢了!!!
非常感谢
再试一下去
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p*i
10
pfu turbo

【在 g*******e 的大作中提到】
: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗?
: 你们都用啥polymerase? 高保真的
: 我们用Phusion,感觉不是很好
: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢!

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l*1
11
Mark!

【在 H*******i 的大作中提到】
: 上面写了啊,只有一次是全放一起(A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer)死活做不出来,最
: 后两两连起来的,那次有一个片段开始PCR就不太正常。
: 其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
: 条件都是
: primer F+R 0.5ul 10mM each
: A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
: dntp 200 μM each
: 5*HFbuffer 10ul
: 5%DMSO
: 60度退火(设计的是68度以上)

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g*e
12
请问你的overlap的各片段一般都是多大?
貌似小片段比较容易overlap
上了大片段就比较困难了
我们现在是1kb-2kb-1kb

【在 H*******i 的大作中提到】
: 3个连起来有那么10多次吧(不成环,成环我就试过几次成功一次。),只有一次有一
: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来,然后分成两步连的(那次是
: 帮别人做的)
: 最多做过5片段连接
: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+,除了个别末端有重复序
: 列的比较麻烦,其他没出过什么问题

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n*w
13
我以前做4个片段overlap, a, b, c, d,
a的d的量正常加,但是b和c是加倍加,然后用phusion,work。
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H*i
14
我映像里没弄过几个都比较大的,一般就是promoter+cds+tag或者+几个spacer(最大
一般1K左右)
最终产物一般都是2K-3K左右
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g*5
15
co mark

【在 l**********1 的大作中提到】
: Mark!
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m*m
16
mark
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