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大片段连接求教
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大片段连接求教# Biology - 生物学
r*l
1 楼
received my green card last week, get lots of help from this board,
here is my timeline.
EB1B, working for a big pharm (I think this definitely helps)
background:
publication: 13 papers, only 1 first author paper (weak), 8 conference
papers (all first author), 1 book chapter (5th author)
Citation: 130 (90 from two review papers, non first author)
review: 9 times for 4 differenct journals
recommendation letters: 6, (1 independent letter from England, 2 from
industry, one from Israel)
Letter from
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s*g
2 楼
刚做完Inspection拿到报告. 有几点疑问向大家请教 (1950年的房子).
1) 地下室漏水
"A complete, new water management system has been installed, including two
(2) sump pumps and an interior perimeter drain. This is an indication of
past water problems. While usually effective in controlling water
problems, interior perimeter drains, if not properly installed, can over a
period of time, result in foundation damage, including collapse. Sump
pumps were tested and functioned properly."
我在另一份Inspection report (relocation company 从房主那买房时做的.in Aug.
2010 before they installed the new basement waterproofing system) 发现
"water peneration is apparent in the crawl space due to efflorescence on
the foundation wall in the crawl space and the water stains of the floor/
slab in the crawl space". and "water penetration is apparent
due to water stains and vines growing from the exterior to the interior at
the window in the basement and on the floor/slab in scattered locations
throughout the basement". Also the owner disclosed that "Basement: water
accumulated during severe rainstorm sump-pump failed to remove water
because electricity went out".
请问大家这 water problems 有多严重. 会不会损坏地基(在报告里, Inspector说从可
见部分看,地基没问题) Relocation company 花了$9000块在8月装了新的BASEMENT
WATERPROOFING SYSTEM, 有用吗?
2) Structural Summary
"The exterior walls appear to be visually plumb. However, the interior
floors are not level in one area. This is an indication of sagging of the
girder(s) or the joists" and
"Note that the floors above the entrance to the crawl space have settled and
the doorways are not square. We could not determine the cause of sag. ...
Further
evaluation may be required" "The building structure appears to be in
generally sound condition, except as noted herein."
请问大家这 structural problems 有多严重? 对一个60年老的房子是常见问题吗?
谢谢大家.同事和AGENT说没大问题 但是第一次买房实在没底.
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d*9
3 楼
4K的大片段要连载体，有什么秘诀没？
多谢多谢了
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A*d
4 楼
GXGX
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m*y
5 楼
新手 please don't buy 60年老的房子. You can't handle it.
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d*p
6 楼
4kb is not a 大片段. Just regular cloning

【在 d**********9 的大作中提到】
: 4K的大片段要连载体，有什么秘诀没？
: 多谢多谢了
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l*m
7 楼
gxgx baozi please
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s*r
8 楼
这个很普通。

【在 d**********9 的大作中提到】
: 4K的大片段要连载体，有什么秘诀没？
: 多谢多谢了
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l*t
9 楼
congrats
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c*r
10 楼
搭车问一下，9.5 kb大片段克隆有高招没？光PCR就快搞死了。。。
胶回收用kit怎么都回收不够，估计是洗脱不下来。刚订了一个Zymo的Zymoclean™
; Large Fragment DNA Recovery Kit在路上。还有什么要准备的？
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c*e
11 楼
Congratulation!
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a*k
12 楼
分两段PCR，做3-way ligation。

8482

【在 c*********r 的大作中提到】
: 搭车问一下，9.5 kb大片段克隆有高招没？光PCR就快搞死了。。。
: 胶回收用kit怎么都回收不够，估计是洗脱不下来。刚订了一个Zymo的Zymoclean™
: ; Large Fragment DNA Recovery Kit在路上。还有什么要准备的？
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k*w
13 楼
Congratulations!
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b*n
14 楼
找个外包吧，如果做起来实在吃力的话
花一个月时间在这上面还不如干点别的

8482

【在 c*********r 的大作中提到】
: 搭车问一下，9.5 kb大片段克隆有高招没？光PCR就快搞死了。。。
: 胶回收用kit怎么都回收不够，估计是洗脱不下来。刚订了一个Zymo的Zymoclean™
: ; Large Fragment DNA Recovery Kit在路上。还有什么要准备的？
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q*1
15 楼
GXGX!
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c*r
16 楼
谢谢，我之前有点担心3-way ligation效率低，想一步搞定。有推荐的protocol吗？

【在 a********k 的大作中提到】
: 分两段PCR，做3-way ligation。
:
: 8482
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L*n
17 楼
congrats

【在 r*****l 的大作中提到】
: received my green card last week, get lots of help from this board,
: here is my timeline.
: EB1B, working for a big pharm (I think this definitely helps)
: background:
: publication: 13 papers, only 1 first author paper (weak), 8 conference
: papers (all first author), 1 book chapter (5th author)
: Citation: 130 (90 from two review papers, non first author)
: review: 9 times for 4 differenct journals
: recommendation letters: 6, (1 independent letter from England, 2 from
: industry, one from Israel)
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c*r
18 楼
多谢建议。外包没有经验，有推荐的公司吗？有点担心老板是否会批准。。。小lab经
费不多，NSF去年的grant现在都没消息。。。

【在 b******n 的大作中提到】
: 找个外包吧，如果做起来实在吃力的话
: 花一个月时间在这上面还不如干点别的
:
: 8482
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m*g
19 楼
GX
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z*8
20 楼
clonetec infusion cloning。简单好用啊！
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I*n
21 楼
congrats
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c*r
22 楼
手上有这个，就是目的片段搞不到足够量，期待试一下。
使用这个kit克隆大片段，你是用vector:insert molar ratio=1:2(看到不少文章里用
这个比例)，还是按照说明里的加几十ng 100ng那样来做？按照molar ratio 1:2的话，
insert的量要超过说明书里的上限了。
谢谢！

【在 z*********8 的大作中提到】
: clonetec infusion cloning。简单好用啊！
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S*9
23 楼
gx
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b*e
24 楼
infusion 效率非常高的，根本不用操心什么浓度。我们把整个infusion反应体系压缩
到2ul，就是只用0.4ul infusion mix，剩下的1.6ul就是vector和inserts的回收产物
分配一下。
再说了，你这个4kb也不长啊，你跑胶回收的时候，把洗脱buffer加热一下，洗脱效率
高很多的。

【在 c*********r 的大作中提到】
: 手上有这个，就是目的片段搞不到足够量，期待试一下。
: 使用这个kit克隆大片段，你是用vector:insert molar ratio=1:2(看到不少文章里用
: 这个比例)，还是按照说明里的加几十ng 100ng那样来做？按照molar ratio 1:2的话，
: insert的量要超过说明书里的上限了。
: 谢谢！
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Y*Z
25 楼
cong! claim what?
Thanks
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c*r
26 楼
4 kb是楼主的，我的是9.5 kb。对9.5 kb左右的片段有经验吗？还有就是in-fusion之
前被实验室同学室温放过夜了，影响大吗？把整个反应体系压缩到2 ul可以节省很多啊
！牛！

【在 b*********e 的大作中提到】
: infusion 效率非常高的，根本不用操心什么浓度。我们把整个infusion反应体系压缩
: 到2ul，就是只用0.4ul infusion mix，剩下的1.6ul就是vector和inserts的回收产物
: 分配一下。
: 再说了，你这个4kb也不长啊，你跑胶回收的时候，把洗脱buffer加热一下，洗脱效率
: 高很多的。
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Y*Z
27 楼
authorship+contribution+review???
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s*i
28 楼
你的载体多大，如果载体跟insert差不多大，是很难插入成功的
如果你试了很长时间也没试出来，建议从简单做起，比如说从9.5k里面找到一个好用的
单酶切位点，分两步上去，或是分三步上去，虽然看上去慢但是总体而言反而节省时间。
因为PCR之后要测序，9.5k的就算构建成功，突变率要高于5k的，不如分成几段，放在
几个载体里面测序无误了再连上去。

【在 c*********r 的大作中提到】
: 4 kb是楼主的，我的是9.5 kb。对9.5 kb左右的片段有经验吗？还有就是in-fusion之
: 前被实验室同学室温放过夜了，影响大吗？把整个反应体系压缩到2 ul可以节省很多啊
: ！牛！
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r*y
29 楼
恭喜恭喜恭喜
沾沾喜气, 包子拿来...

【在 r*****l 的大作中提到】
: received my green card last week, get lots of help from this board,
: here is my timeline.
: EB1B, working for a big pharm (I think this definitely helps)
: background:
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: industry, one from Israel)
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c*r
30 楼
谢谢回复。载体4k多一点。说的有道理，我再仔细考虑一下。

间。

【在 s*****i 的大作中提到】
: 你的载体多大，如果载体跟insert差不多大，是很难插入成功的
: 如果你试了很长时间也没试出来，建议从简单做起，比如说从9.5k里面找到一个好用的
: 单酶切位点，分两步上去，或是分三步上去，虽然看上去慢但是总体而言反而节省时间。
: 因为PCR之后要测序，9.5k的就算构建成功，突变率要高于5k的，不如分成几段，放在
: 几个载体里面测序无误了再连上去。
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g*e
31 楼
very fast.恭喜恭喜
沾点喜气...
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b*e
32 楼
9.5K我做过assembly PCR，但是用普通的酶切连接做的clone。PCR以后，突变率还是挺
高的，还是分段搞好、测序以后，切出来，再连接比较稳妥。
室温过夜，会完蛋吧？酶活就没了啊。压缩到2ul是我的一个同事测试出来的，呵呵。
我们老板是省钱牛人，在他带领下，大家都好有省钱的激情。。。汗~

【在 c*********r 的大作中提到】
: 4 kb是楼主的，我的是9.5 kb。对9.5 kb左右的片段有经验吗？还有就是in-fusion之
: 前被实验室同学室温放过夜了，影响大吗？把整个反应体系压缩到2 ul可以节省很多啊
: ！牛！
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r*e
33 楼
GX!

【在 r*****l 的大作中提到】
: received my green card last week, get lots of help from this board,
: here is my timeline.
: EB1B, working for a big pharm (I think this definitely helps)
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: industry, one from Israel)
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c*r
34 楼
又学习了，多谢！我的9.5kb的片段用NEB的Q5能P出来，就是产量低一些。看样子还是
分段搞的好。
我老板管钱比较严，很多细节会亲自过问，所以能省就省，期待多多分享省钱大法啊！

【在 b*********e 的大作中提到】
: 9.5K我做过assembly PCR，但是用普通的酶切连接做的clone。PCR以后，突变率还是挺
: 高的，还是分段搞好、测序以后，切出来，再连接比较稳妥。
: 室温过夜，会完蛋吧？酶活就没了啊。压缩到2ul是我的一个同事测试出来的，呵呵。
: 我们老板是省钱牛人，在他带领下，大家都好有省钱的激情。。。汗~
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y*u
35 楼
GXGX!

【在 r*****l 的大作中提到】
: received my green card last week, get lots of help from this board,
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w*t
36 楼
我用的是clonetech的INFUSION，载体4KB，连了4个片段进去，是在一个反应，最后大
小11KB，挑了4个有两个阳性。不是很复杂，但是设计引物的时候要费点事，注意5’，
3‘设计的时候不要搞错。

【在 d**********9 的大作中提到】
: 4K的大片段要连载体，有什么秘诀没？
: 多谢多谢了
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d*s
37 楼
gxgx， 占喜气
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z*8
38 楼
用过4段连接，感觉不错，基本挑的每个都是对的。但是这个kit，很有意思，在我们实
验室只有亚洲女生用这个才做的出来，别人做就是死活不出来，我觉得别人做的时候也
挺仔细的，但是就是出不来，其实，我也不知道自己有什么诀窍，就照着protocol来就
有了。还有，就是如果环境湿度比较大的话，不要买那个dry kit（粉末状的），不过
估计现在也不一定生产了。环境湿度大的地方要用买来放下-20冰箱的reagent
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s*e
39 楼
gongxigongxi
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c*r
40 楼
哈，还有这等奇事？克隆完这个大片段，我也需要做几个三四段连接的反应，看来需要
叫上LP来客串一下了。。。

【在 z*********8 的大作中提到】
: 用过4段连接，感觉不错，基本挑的每个都是对的。但是这个kit，很有意思，在我们实
: 验室只有亚洲女生用这个才做的出来，别人做就是死活不出来，我觉得别人做的时候也
: 挺仔细的，但是就是出不来，其实，我也不知道自己有什么诀窍，就照着protocol来就
: 有了。还有，就是如果环境湿度比较大的话，不要买那个dry kit（粉末状的），不过
: 估计现在也不一定生产了。环境湿度大的地方要用买来放下-20冰箱的reagent
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R*n
41 楼
Congrats! PP? 140 approve date?
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b*e
42 楼
不客气啊！省钱大法是需要老板有激情和自己动手修理仪器的能力的啊，我老板热爱修
理玩意儿。

【在 c*********r 的大作中提到】
: 又学习了，多谢！我的9.5kb的片段用NEB的Q5能P出来，就是产量低一些。看样子还是
: 分段搞的好。
: 我老板管钱比较严，很多细节会亲自过问，所以能省就省，期待多多分享省钱大法啊！
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R*d
43 楼
Congrats!

【在 r*****l 的大作中提到】
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: here is my timeline.
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q*8
44 楼
mark...
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s*g
45 楼
Congratulations!

【在 r*****l 的大作中提到】
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k*n
46 楼
载体去磷酸化。再做ligation～
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w*c
47 楼
gx!!!
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S*r
48 楼
我连过10kb的片段，invitrogen有一种专门的感受态用于大片段，电转可能好一点，多
做一些连接梯度。

8482;

【在 c*********r 的大作中提到】
: 搭车问一下，9.5 kb大片段克隆有高招没？光PCR就快搞死了。。。
: 胶回收用kit怎么都回收不够，估计是洗脱不下来。刚订了一个Zymo的Zymoclean™
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H*s
49 楼
恭喜,赞效率!
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r*l
50 楼
claim authorship, contribution and review.
No pp. I140 online still appears as 'initial review'.

【在 R******n 的大作中提到】
: Congrats! PP? 140 approve date?
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z*o
51 楼
GXGX!!!
baozi pls
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r*y
52 楼
恭喜恭喜
沾沾喜气
包子

【在 r*****l 的大作中提到】
: received my green card last week, get lots of help from this board,
: here is my timeline.
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: papers (all first author), 1 book chapter (5th author)
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: review: 9 times for 4 differenct journals
: recommendation letters: 6, (1 independent letter from England, 2 from
: industry, one from Israel)
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l*j
53 楼
GX

【在 r*****l 的大作中提到】
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: here is my timeline.
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k*g
54 楼
Congs!
that is fast.

【在 r*****l 的大作中提到】
: claim authorship, contribution and review.
: No pp. I140 online still appears as 'initial review'.
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g*8
55 楼
cong and baozi plz!
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G*0
56 楼
恭喜恭喜
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G*0
57 楼
恭喜恭喜
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G*0
58 楼
恭喜恭喜
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