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Help: mouse genotyping by sequencing

Help: mouse genotyping by sequencing# Biology - 生物学

j*W2013-05-13 07:05

1 楼

希望直接从knock-in mouse看engineered sites.试了PCR followed by gel
purification of the correct-sized band and sequencing.每次都只能读到某区段就
读不下去了.有人知道是怎么回事吗? 愁死了.谢谢!

q*72013-05-13 07:05

2 楼

看不懂你的意思。你是直接测PCR产物吗？如果PCR回收的片段里有洗液的话，可以抑制
TAQ酶的活性而导致测序信号不好，测序列短，严重时可能没有任何信号。你可以试一
下这个公司的PCR纯化盒，回收PCR产物中没有洗液，而且很便宜。对你直接PCR测序肯
定有帮助。
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification

D*a2013-05-13 07:05

3 楼

PCR产物即使带很亮也很脏，不纯，你要再nested PCR一下才能有纯的产物，
我们测1000左右的老鼠genome是这么测的：设计引物能到1200左右bp的片段，引物PCR
跑胶确认清晰无杂带后，重新用这两个引物拿genomic DNA做第一个 PCR，做10几个
cycle左右，然后取1 微升左右产物出来，当做第二次的原始DNA，用另外设计的至少一
端nested的引物再做满
36循环，第二次的PCR产物几微升点样看带的质量，剩下的纯化去除dNTP，酶等杂质，
去测序。
另外就是你测序的长度应该是有限制的，我们是分段测然后自己拼的，测太长很明显那
个峰就慢慢越来越小越来越小。

j*W2013-05-13 07:05

4 楼

PCR 3kb fragment后, 我有用QIAGEN gel purification kit纯化, 再送的测序.QIAGEN
gel purification kit不够好?

【在 q***7 的大作中提到】

: 看不懂你的意思。你是直接测PCR产物吗？如果PCR回收的片段里有洗液的话，可以抑制
: TAQ酶的活性而导致测序信号不好，测序列短，严重时可能没有任何信号。你可以试一
: 下这个公司的PCR纯化盒，回收PCR产物中没有洗液，而且很便宜。对你直接PCR测序肯
: 定有帮助。
: http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification

j*W2013-05-13 07:05

5 楼

从来没有跑过nested PCR. Google了以下,好象应该试一下.普通ＰＣＲ targeting
vector, 同样操作能做出来，genomic DNA就死活不行．希望nested PCR能clean it up.

PCR

【在 D*a 的大作中提到】

: PCR产物即使带很亮也很脏，不纯，你要再nested PCR一下才能有纯的产物，
: 我们测1000左右的老鼠genome是这么测的：设计引物能到1200左右bp的片段，引物PCR
: 跑胶确认清晰无杂带后，重新用这两个引物拿genomic DNA做第一个 PCR，做10几个
: cycle左右，然后取1 微升左右产物出来，当做第二次的原始DNA，用另外设计的至少一
: 端nested的引物再做满
: 36循环，第二次的PCR产物几微升点样看带的质量，剩下的纯化去除dNTP，酶等杂质，
: 去测序。
: 另外就是你测序的长度应该是有限制的，我们是分段测然后自己拼的，测太长很明显那
: 个峰就慢慢越来越小越来越小。

D*a2013-05-13 07:05

6 楼

你切胶纯化留下的是PCR产物这个没问题，但是那个胶亮的地方里面不是只有你想要那
个片段，很多乱七八糟的genome瞎扩的东西被优势产物夹住了只能跟大家一起跑，虽然
你的目标带是绝大部分。一般加了样的well都比旁边的亮一点，就是因为乱七八糟的
DNA背景。
所以要nested 这样第二对引物只有你的PCR产物可以结合上去，才能纯。而且第二次
PCR出来去跑胶，well那一长条稍微亮点的就完全没了。如果条件受限nested也可以只
有一端。
另外为神马第一个PCR不要跑完，因为普通PCR有错配，如果跑完36个循环，你会稀释很
多，这样你可能正好挑到错配的产物造成你认为KI失败，所以跑个十来个循环富集一下
模版就可以了，这一步不用纯化。
我说得这个方法整个不用纯化胶的kit，需要的是纯化PCR产物的kit。跑胶是为了检验
你的PCR，但是你寄去的是你点样留下来的。

QIAGEN

【在 j**W 的大作中提到】

: PCR 3kb fragment后, 我有用QIAGEN gel purification kit纯化, 再送的测序.QIAGEN
: gel purification kit不够好?

D*a2013-05-13 07:05

7 楼

因为你vector序列单一，genomic DNA那么长，稍微短点的引物就blast出来一堆位点，
毕竟36个循环，这些东西也没闲着。

up.

【在 j**W 的大作中提到】

: 从来没有跑过nested PCR. Google了以下,好象应该试一下.普通ＰＣＲ targeting
: vector, 同样操作能做出来，genomic DNA就死活不行．希望nested PCR能clean it up.
:
: PCR

x*d2013-05-13 07:05

8 楼

PCR
赞专业!

【在 D*a 的大作中提到】

j*W2013-05-13 07:05

9 楼

受教了。多谢！还有一个问题：两次PCR都不切right-size bands,不会有很多很多wild
type allele被放大从而影响sequencing吗？

【在 D*a 的大作中提到】

: 你切胶纯化留下的是PCR产物这个没问题，但是那个胶亮的地方里面不是只有你想要那
: 个片段，很多乱七八糟的genome瞎扩的东西被优势产物夹住了只能跟大家一起跑，虽然
: 你的目标带是绝大部分。一般加了样的well都比旁边的亮一点，就是因为乱七八糟的
: DNA背景。
: 所以要nested 这样第二对引物只有你的PCR产物可以结合上去，才能纯。而且第二次
: PCR出来去跑胶，well那一长条稍微亮点的就完全没了。如果条件受限nested也可以只
: 有一端。
: 另外为神马第一个PCR不要跑完，因为普通PCR有错配，如果跑完36个循环，你会稀释很
: 多，这样你可能正好挑到错配的产物造成你认为KI失败，所以跑个十来个循环富集一下
: 模版就可以了，这一步不用纯化。

D*a2013-05-13 07:05

10 楼

晕你测heterozygote啊，不能先交一下交出homozygote来么，也就三个星期。
这个就是最大的问题了，hetero的两个带本来就序列一样，杂产物更多，而且又差不多
长，在胶上互相混尤其明显，你读到一半读不下去就是到了野生型位点了。最好是拿到
纯合老鼠测，实在不行你的野生带能不能酶切了？我们当时是等到纯合老鼠，酶切是我
自己想觉得行。不过怎么都要做nested pcr 才能测序。

wild

【在 j**W 的大作中提到】

: 受教了。多谢！还有一个问题：两次PCR都不切right-size bands,不会有很多很多wild
: type allele被放大从而影响sequencing吗？

q*72013-05-13 07:05

11 楼

Qiagen做为柱提取DNA的老大，从来没有想着怎么改进他们的产品。他们柱子elute出来
的DNA大都含有洗液，尤其是Gel Extraction, PCR purification， and RNAeasy kits
。你用个连有真空的小枪头在最后一步要elute你的DNA时在柱子里面的那个垫圈上吸吸
看有什么东西。你会看到小枪头里都是洗液。Green BioResearch公司，就想到了这一
点，垫圈上设计了个小洞，这样就不会有洗液留在上面了。这样你elute出来的样品里
就不会含有洗液，而不会抑制后面的酶的活性了。
你可以看一下这个连接
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification

QIAGEN

【在 j**W 的大作中提到】

: PCR 3kb fragment后, 我有用QIAGEN gel purification kit纯化, 再送的测序.QIAGEN
: gel purification kit不够好?

q*72013-05-13 07:05

12 楼

我建议他应该第一次用GEL回收，这样第一步就去除了绝大多数的GENOMIC DNA，然后后
面看情况。如果还是有很多的杂带，还是要用胶回收，然后再做PCR。
另外，找你wildtype allele上有但KI allele上没有的酶切位点的那个酶消化一下的
PCR产物，胶回收后再做PCR，这样去除了wildtype allele信号。
如果PCR产物不纯，肯定测不出东西来。信号就乱套了。我曾经测过不纯的质粒，都有
测序引物结合点，结果什么信号都没有（很弱的杂信号）
另外，你说的BLAST一堆位点，这可以提高一下退火温度就基本上可以解决。因为他们
是部分binding。

【在 D*a 的大作中提到】

D*a2013-05-13 07:05

13 楼

第一次如果跑到胶上能看出来的程度，很容易过度稀释，把几个在pcr中突变的分子测
序了，其实老鼠是好的。我说的方法，即使有突变，因为太少，也不会对真正结果造成
影响。
如果按你的方法就不能进行第二步扩增，直接拿第一步产物测序，这个我没做过。如果
你做过的话那应该也可以。

【在 q***7 的大作中提到】

: 我建议他应该第一次用GEL回收，这样第一步就去除了绝大多数的GENOMIC DNA，然后后
: 面看情况。如果还是有很多的杂带，还是要用胶回收，然后再做PCR。
: 另外，找你wildtype allele上有但KI allele上没有的酶切位点的那个酶消化一下的
: PCR产物，胶回收后再做PCR，这样去除了wildtype allele信号。
: 如果PCR产物不纯，肯定测不出东西来。信号就乱套了。我曾经测过不纯的质粒，都有
: 测序引物结合点，结果什么信号都没有（很弱的杂信号）
: 另外，你说的BLAST一堆位点，这可以提高一下退火温度就基本上可以解决。因为他们
: 是部分binding。

j*W2013-05-13 07:05

14 楼

只用过Qiagen。最后一步要elute前在柱子里面的那个垫圈上的残余液体，我以前就注
意到过。只是不知道影响会这么大。看来可以试试Green BioResearch。多谢。

kits

【在 q***7 的大作中提到】

: Qiagen做为柱提取DNA的老大，从来没有想着怎么改进他们的产品。他们柱子elute出来
: 的DNA大都含有洗液，尤其是Gel Extraction, PCR purification， and RNAeasy kits
: 。你用个连有真空的小枪头在最后一步要elute你的DNA时在柱子里面的那个垫圈上吸吸
: 看有什么东西。你会看到小枪头里都是洗液。Green BioResearch公司，就想到了这一
: 点，垫圈上设计了个小洞，这样就不会有洗液留在上面了。这样你elute出来的样品里
: 就不会含有洗液，而不会抑制后面的酶的活性了。
: 你可以看一下这个连接
: http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
:
: QIAGEN

j*W2013-05-13 07:05

15 楼

当时还没有homozygous. 今天刚做了genotyping证实拿到了homozygous。这样不管用
nested PCR还是用qq007说的方法，都要比heterozygous好。多谢！

【在 D*a 的大作中提到】

: 晕你测heterozygote啊，不能先交一下交出homozygote来么，也就三个星期。
: 这个就是最大的问题了，hetero的两个带本来就序列一样，杂产物更多，而且又差不多
: 长，在胶上互相混尤其明显，你读到一半读不下去就是到了野生型位点了。最好是拿到
: 纯合老鼠测，实在不行你的野生带能不能酶切了？我们当时是等到纯合老鼠，酶切是我
: 自己想觉得行。不过怎么都要做nested pcr 才能测序。
:
: wild

j*W2013-05-13 07:05

16 楼

另外一个位点（见图)，也是heterozygous.当时用Ｐ３－Ｐ４做PCR, gel purified
band with size of targeted allele, but not wild type allele　（两个分得很开)
, P1做sequencing得到wild type sequence，虽然读的序列很短.当时真是晴天霹雳！
有多大可能性是我图上画的mis-targeted的情况？用homozygous genomic DNA做nested
PCR会有不一样的结果吗？

【在 D*a 的大作中提到】

m*M2013-05-13 07:05

17 楼

你的P３肯定在GFP上吧？你用P３和P４扩heterozygous只能扩出一个targeted allele
呀。不可能扩出Wildtype allele呀。用P１做测序引物，前面一点肯定是Wildtype序列
呀（不太确定具体多长，也不确定你具体短到何种程度，看到Exon1了吗？）。我建议
你在GFP后面的序列上设计两个相反的引物进行分别测序

j*W2013-05-13 07:05

18 楼

用P１做测序引物，过了该是loxP的还是Wildtype序列。看到Exon1了。所以我觉得我实
际上是造了我图上画的mis-targeted allele 了。多希望自己interprete错了呀。

allele

【在 m****M 的大作中提到】

: 你的P３肯定在GFP上吧？你用P３和P４扩heterozygous只能扩出一个targeted allele
: 呀。不可能扩出Wildtype allele呀。用P１做测序引物，前面一点肯定是Wildtype序列
: 呀（不太确定具体多长，也不确定你具体短到何种程度，看到Exon1了吗？）。我建议
: 你在GFP后面的序列上设计两个相反的引物进行分别测序

m*M2013-05-13 07:05

19 楼

就算是你所说的mistargeted allele也不会扩增出wildtype allele。你根据你什么结
果说是＂所以我觉得我实际上是造了我图上画的mis-targeted allele 了。＂？
你不要老是想着别人知道你没有说的东西。你让别人帮忙帮你分析，你要尽量把你的信
息给全。没有人有时间来回问你，然后回答，问你然后回答的。你给老板汇报工作是
这样的吗？

【在 j**W 的大作中提到】

: 用P１做测序引物，过了该是loxP的还是Wildtype序列。看到Exon1了。所以我觉得我实
: 际上是造了我图上画的mis-targeted allele 了。多希望自己interprete错了呀。
:
: allele

j*W2013-05-13 07:05

20 楼

因为用Ｐ３－Ｐ４做的PCR，所以做sequencing的fragment应该含GFP，不会是wildtype
allele.
但是用P1做sequencing得到"wild type sequence" (不是wildtype allele),并且都过
了该是后面的loxP的地方但是还是没看见loxP。
又不是wildtype allele，后面的loxP又不见了，所以就只能是我图上画的mis-
targeted allele这个四不象了。
我不知道还缺什么信息。不好意思。我现在说清楚了么？

【在 m****M 的大作中提到】

: 就算是你所说的mistargeted allele也不会扩增出wildtype allele。你根据你什么结
: 果说是＂所以我觉得我实际上是造了我图上画的mis-targeted allele 了。＂？
: 你不要老是想着别人知道你没有说的东西。你让别人帮忙帮你分析，你要尽量把你的信
: 息给全。没有人有时间来回问你，然后回答，问你然后回答的。你给老板汇报工作是
: 这样的吗？

D*a2013-05-13 07:05

21 楼

那你就是看到loxp了，那怎么也变不成3里面那个只少了个loxp的啊。你用p3p4怎么也
出不来wt allele啊，什么叫“两个分得很开”？
你说看到exon1了是有多清楚？你原帖的意思是读不下去了，我理解是两个以上不同碱
基的峰，你是这个意思吗？那这里看到exon1又是什么意思?
你把产物多长该从哪里读多长实际看到什么多长画画吧，图上没有比例不知道怎么说

【在 j**W 的大作中提到】

m*M2013-05-13 07:05

22 楼

刚才还有点怀疑自己的阅读能力。看他前后给的信息很难判断是怎么回事。看来你老也
看不明白呀。俺是不准备往下接了。

【在 D*a 的大作中提到】

: 那你就是看到loxp了，那怎么也变不成3里面那个只少了个loxp的啊。你用p3p4怎么也
: 出不来wt allele啊，什么叫“两个分得很开”？
: 你说看到exon1了是有多清楚？你原帖的意思是读不下去了，我理解是两个以上不同碱
: 基的峰，你是这个意思吗？那这里看到exon1又是什么意思?
: 你把产物多长该从哪里读多长实际看到什么多长画画吧，图上没有比例不知道怎么说

j*W2013-05-13 07:05

23 楼

见新图并更正。
Sequencing was done with P2, which is within Exon 1. The resulting sequence
include region A (part of Exon 1 starting from P2 to before NotI site)
followed directly by region C (Intron 1 after the AscI site). NotI and AscI
are the enzymes used to put the construct together.
现在清楚了吗？

【在 D*a 的大作中提到】

j*W2013-05-13 07:05

24 楼

图在这里.

q*72013-05-13 07:05

25 楼

看来你不但好多东西没有说，而且表达还真是有问题。你的中文真的很难理解，尤其是
上面的解释。还不如英文清楚，虽然英文也有很多错误。
你说RESULTING SEQUENCE包括。。。。（我们一般从测序引物的那边说起，你这却从离
引物最远的那边说起）说明序列都测过过那个LOXP区域了。但是你中文里又说P２之后
７０BP就停了。
你不是搞分子生物学出身的吧？用P２做引物测序后面都是DOWNSTREAM，应该说P２后７
０BP。这targeting vector也不是你构建的吧？知道为什么要扩那么长吗？你如果能回
答出这个问题说明你还懂些分子生物学。
你这图比例严重失调，GFP６００BP左右，你EXON１５００BP左右，图中差别却是几倍
。还有，你P３应该在GFP后面离EXON１１００BP左右的地方，你却标到了GFP的中间。
好啦，现在回到你的问题。你不应该用P２来当测序引物，离你需要确定序列的地方太
近。
最早测序时，测序引物后面５０BP左右（甚至到１００BP以上）的序列是读不出来的。
所以那时的测序引物一般设计在需要确定序列的上游至少５０BP以上。大多数引物都
设计在要确定的序列上游１００BP左右。现在技术试剂和仪器等的提高，测序引物后面
一般
２０个BP左右就可以读到序列。但是你要知道太靠近测序引物的信号还是不太稳，有时
信号特强或特弱。我设计引物一般都设计在要确定的序列上游５０左右。就这样有时候
由于GC的高低，有时需要拿电子彩图仔细对比才能确定靠近引物很近的信号／序列。设
计引物设计的太上游，后面测到的就相应短了。所以需要根据自己的需要来BALANCE，
尤其是需要测的序列很长，需要连着测几个反应时。
根据你标出的，P２距LOX只有５０BP，你测的又是用PCR产物，引物后面测不到的序列会
更长。而且，LOX是个发卡二级结构，会更困难些。象你这种情况，你就是要看LOXP 位
点在不在。我建议你离它至少２００BP的地方设计引物，从上游和下游都测一下。一般
情况下引物后面２００BP到６００BP的信号最好，最可信。
如果是这个原因，发我３０个包子，呵呵

D*a2013-05-13 07:05

26 楼

我也觉得是这个原因，p2后面接着就是loxP，读不出来正常。
他这是用p2测序，测出来是wt序列不是很正常吗，
前面说用p1测序（用P1测序是把P1加到管子里，用P2测序是把P2加到管子里，这个怎么
还能说混了。。。），还测出来wt，我就纳了闷了。
如果说两头要分别测，那应该P3跨到GFP外面，上游的wt 序列那里，否则很难理解为神
马要扩4k的产物出来，测的连1k都不到。
还有一个疑问就是不是筛ES需要测序的吗（我没筛过，但是感觉上是应该测啊），就
算老鼠要再测序确认也应该是现成的protocol啊

【在 q***7 的大作中提到】

: 看来你不但好多东西没有说，而且表达还真是有问题。你的中文真的很难理解，尤其是
: 上面的解释。还不如英文清楚，虽然英文也有很多错误。
: 你说RESULTING SEQUENCE包括。。。。（我们一般从测序引物的那边说起，你这却从离
: 引物最远的那边说起）说明序列都测过过那个LOXP区域了。但是你中文里又说P２之后
: ７０BP就停了。
: 你不是搞分子生物学出身的吧？用P２做引物测序后面都是DOWNSTREAM，应该说P２后７
: ０BP。这targeting vector也不是你构建的吧？知道为什么要扩那么长吗？你如果能回
: 答出这个问题说明你还懂些分子生物学。
: 你这图比例严重失调，GFP６００BP左右，你EXON１５００BP左右，图中差别却是几倍
: 。还有，你P３应该在GFP后面离EXON１１００BP左右的地方，你却标到了GFP的中间。

D*a2013-05-13 07:05

27 楼

正常的PCR错配比例很低而且每个碱基的几率是一样的，所以错配的只是测序里面的背
景噪音，对测序结果没有任何影响。只有在需要单个分子的时候，比如做分子克隆或者
做nested PCR时，才要考虑到单个的分子可能有突变。nested PCR解决这个问题的方法
就是不要大量稀释，而是降低循环数（提高模版来源于不同PCR产物的数量，同时降低
了PCR反应的次数所以也减少了错配的次数）

sequence
region
NotI
吗,

【在 j**W 的大作中提到】

: 图在这里.

l*12013-05-13 07:05

28 楼

GC contents of that P2 to AscI site if >65% DMSO 5% to buffer or try
Clontech GC rich kit
Cycle time 35 that is no problem
pls refer
GC-rich PCR concerns DNA templates with high GC content, which is defined as
the percentage of guanine-cytosine base pairs. When amplifying templates
with >60% GC content (i.e 5' ends of most mammalian cDNAs), the three
hydrogen bonds shared by GC pairs lead to enhanced thermostability, which is
problematic for un-optimized Taq polymerase systems.
http://www.clontech.com/US/Support/Applications/PCR/GC_Rich_PCR
>>>
发信人: jasW (夏夜轻风), 信区: Biology
标题: Re: Help: mouse genotyping by sequencing
发信站: BBS 未名空间站 (Sat May 18 00:34:42 2013, 美东)
见新图(在下一层楼)并更正。
Sequencing was done with P2, which is within Exon 1. The resulting sequence
include region C (Intron 1 after the AscI site) followed directly by region
A (part of Exon 1 starting ~70bp before P2 to right before NotI site). NotI
and AscI are the enzymes used to put the construct together.
现在清楚了吗？
P3P4 PCR不可能有wt allele (原先“两个分得很开”说错了).但是后面的loxP不见了
。那不是只可能是homologous recombination时是recombine到E1而不是Intron上了吗,
虽然E1只有~500bp？只是奇怪的是能sequence出来的序列很短，基本就到P2前~70bp就
没了.你以前介绍过nested PCR之后,我就希望说会不会是heterozygous加上>30cycle的
PCR导致的错误读序.
>>

>

【在 D*a 的大作中提到】

s*r2013-05-13 07:05

29 楼

他的意思是他们在exon和intron中间插了个loxP，但是sequence出来的exon后面直接就
是intron，那个loxP不见了，看上去就和wt一样。扩4k很正常，保险点的PCR一般是要
flank homo arm的看当时es怎么做的了，当然southern啥的都做了，扩短一点可能问题
也不大。
建议楼主仔细查查这个knockin当时是怎么做的，那个位置是不是应该有这个loxP，这
个设计图看着很奇怪，是不是漏了点啥或者有地方画错了。另外可以用P1测一下看看能
不能测到GFP cassette，这个长度测序末尾应该能测到外源序列的，那就确信测得是
targeted allele了

【在 D*a 的大作中提到】

: 我也觉得是这个原因，p2后面接着就是loxP，读不出来正常。
: 他这是用p2测序，测出来是wt序列不是很正常吗，
: 前面说用p1测序（用P1测序是把P1加到管子里，用P2测序是把P2加到管子里，这个怎么
: 还能说混了。。。），还测出来wt，我就纳了闷了。
: 如果说两头要分别测，那应该P3跨到GFP外面，上游的wt 序列那里，否则很难理解为神
: 马要扩4k的产物出来，测的连1k都不到。
: 还有一个疑问就是不是筛ES需要测序的吗（我没筛过，但是感觉上是应该测啊），就
: 算老鼠要再测序确认也应该是现成的protocol啊

l*12013-05-13 07:05

30 楼

Southern Bloting that is of course,
furthermore,
Western Blotting of that knocked in EXONs expressioned protein as 保险点的
Knockin check

j*W2013-05-13 07:05

31 楼

You are right about a couple of things.I switch field and learned biology (
not including molecular biology) in English.And I did not make the targeting
vector. I took over the project starting from agouti mouse. Please bear
with me if I could not be clearer. I am sorry about the confusion on the
primer used for sequencing. We did sequencing with both P1 and P2. One came
back with no good sequence at all. From the sequencing result of the other,
it seems to me like P1. The sequencing result covers part of region C (
Intron 1 after the AscI site, but Intron 1 close to P1 cannot be read ---
exactly both you and Dua were talking about if P1 is the primer) followed
directly by region A (part of Exon 1 starting ~70bp before P2 to right
before NotI site --- another evidence support P1 is the primer). If that is
the case,the sequencing primer is ~150bp upstream of loxP so that the
sequencing should be alright. Then where is loxP?
The reason for PCR such a big fragment is that those are the only primers
that we had at hand to cover that region which include GFP and loxP.
The previous person sequenced the targeting vector but not ES cells.That is
how things were done here and they made a lot of lines and never had problem
. But I really hope that it works again this time and maybe it is just my
PCR/sequencing had some problem as I am not a molecular biologist.Any
suggestion is welcome and thanks a lot for your help.

【在 q***7 的大作中提到】