d*i
2 楼
你$25, 我$25
c*8
3 楼
正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
，都不成功。
都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
，但酶切鉴定也不对。
现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
，都不成功。
都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
，但酶切鉴定也不对。
现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
l*2
4 楼
刚看到有个更新贴，找到我要的信息了，谢谢
M*g
5 楼
Try Gibson Assembly plus NEB 10 beta competent cells from NEB. I now use
Gibson Assembly to do all of my cloning work. Very easy, and none of them
failed.
Good luck.
Gibson Assembly to do all of my cloning work. Very easy, and none of them
failed.
Good luck.
p*e
6 楼
再找一个酶切位点，分步克隆上去。载体和基因大小太接近。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
n*3
7 楼
你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
序鉴定没有问题
序鉴定没有问题
s*i
8 楼
你的载体片段多大？如果载体片段5～7k，几乎不可能得到养性克隆，最好载体和
insert的大小差距比较大，这样容易连接成功。
如果出现载体跟insert差不多大小的情况，最好分段克隆上去，或是用Gibson
Assembly
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
insert的大小差距比较大，这样容易连接成功。
如果出现载体跟insert差不多大小的情况，最好分段克隆上去，或是用Gibson
Assembly
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
k*n
9 楼
我不是高手，但是这方法简单靠谱
【在 n****3 的大作中提到】
: 你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
: 序鉴定没有问题
【在 n****3 的大作中提到】
: 你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
: 序鉴定没有问题
d*i
10 楼
在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
。
。
a*1
11 楼
这招太损了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
x*2
12 楼
我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
不是想要的。
请问有什么诀窍么？
谢谢！
我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
不是想要的。
请问有什么诀窍么？
谢谢！
我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
b*n
13 楼
什么学校还有自产的DH5alpha competant cell啊？
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
y*s
14 楼
太扯了
triple-ligation的难度提高10倍吧
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
triple-ligation的难度提高10倍吧
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
y*s
15 楼
这个就是片段太大转化效率低的问题
去买个10^9的超级感受态细胞，你的问题立马解决
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
去买个10^9的超级感受态细胞，你的问题立马解决
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
H*i
16 楼
和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
y*s
17 楼
原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
可以提高成功率
我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
【在 H*******i 的大作中提到】
: 和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
: 如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
可以提高成功率
我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
【在 H*******i 的大作中提到】
: 和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
: 如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
y*5
18 楼
你自己的载体上这两个酶切位点挨得近不近？如果是相邻的两个，那么有一个酶没有切
开。要换酶。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
开。要换酶。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
y*5
19 楼
哦，楼上有人说的对10K以上的话，要用电转化法，或买高效的转化态细胞。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
l*a
20 楼
顶礼膜拜一下，幸好你不是我师兄，不然得走多少弯路。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
d*i
21 楼
既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
收回我说的吧。对不起大家了。
我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
再次对大家表示对不起！
收回我说的吧。对不起大家了。
我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
再次对大家表示对不起！
m*z
22 楼
信息量太少了。载体CIP了吗？什么酶切位点？什么载体？酶切鉴定怎么不对？可能性
太多啦。
我做过9kb+9kb的平末端连接，PUC vector和lentiviral vector都做过，转的是自己做
的感受态，都没有问题。载体要CIP干净，连接要过夜，比例1:1左右。其他没有了。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
太多啦。
我做过9kb+9kb的平末端连接，PUC vector和lentiviral vector都做过，转的是自己做
的感受态，都没有问题。载体要CIP干净，连接要过夜，比例1:1左右。其他没有了。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
m*z
23 楼
又是一个。。。克隆不是自己想要的，到底怎么不是？即使是失败的实验也可以告诉你
很多东西的。
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
很多东西的。
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
z*1
24 楼
问题解决了么？
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
s*i
25 楼
我挺你，我经常做三段连，成功率非常高；有两次做过四段连，虽然得到我想要的，但
是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 d****i 的大作中提到】
: 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
: 收回我说的吧。对不起大家了。
: 我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
: 同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
: 再次对大家表示对不起！
是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 d****i 的大作中提到】
: 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
: 收回我说的吧。对不起大家了。
: 我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
: 同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
: 再次对大家表示对不起！
s*i
26 楼
为什么说做三段连就不懂分子克隆原理？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 y******s 的大作中提到】
: 原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
: 可以提高成功率
: 我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 y******s 的大作中提到】
: 原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
: 可以提高成功率
: 我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
b*2
27 楼
做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
c*8
28 楼
正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
，都不成功。
都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
，但酶切鉴定也不对。
现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
，都不成功。
都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
，但酶切鉴定也不对。
现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
M*g
29 楼
Try Gibson Assembly plus NEB 10 beta competent cells from NEB. I now use
Gibson Assembly to do all of my cloning work. Very easy, and none of them
failed.
Good luck.
Gibson Assembly to do all of my cloning work. Very easy, and none of them
failed.
Good luck.
p*e
30 楼
再找一个酶切位点，分步克隆上去。载体和基因大小太接近。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
n*3
31 楼
你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
序鉴定没有问题
序鉴定没有问题
s*i
32 楼
你的载体片段多大？如果载体片段5～7k，几乎不可能得到养性克隆，最好载体和
insert的大小差距比较大，这样容易连接成功。
如果出现载体跟insert差不多大小的情况，最好分段克隆上去，或是用Gibson
Assembly
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
insert的大小差距比较大，这样容易连接成功。
如果出现载体跟insert差不多大小的情况，最好分段克隆上去，或是用Gibson
Assembly
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
k*n
33 楼
我不是高手，但是这方法简单靠谱
【在 n****3 的大作中提到】
: 你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
: 序鉴定没有问题
【在 n****3 的大作中提到】
: 你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
: 序鉴定没有问题
d*i
34 楼
在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
。
。
a*1
35 楼
这招太损了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
x*2
36 楼
我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
不是想要的。
请问有什么诀窍么？
谢谢！
我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
不是想要的。
请问有什么诀窍么？
谢谢！
我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
b*n
37 楼
什么学校还有自产的DH5alpha competant cell啊？
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
y*s
38 楼
太扯了
triple-ligation的难度提高10倍吧
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
triple-ligation的难度提高10倍吧
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
y*s
39 楼
这个就是片段太大转化效率低的问题
去买个10^9的超级感受态细胞，你的问题立马解决
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
去买个10^9的超级感受态细胞，你的问题立马解决
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
H*i
40 楼
和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
y*s
41 楼
原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
可以提高成功率
我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
【在 H*******i 的大作中提到】
: 和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
: 如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
可以提高成功率
我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
【在 H*******i 的大作中提到】
: 和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
: 如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
y*5
42 楼
你自己的载体上这两个酶切位点挨得近不近？如果是相邻的两个，那么有一个酶没有切
开。要换酶。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
开。要换酶。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
y*5
43 楼
哦，楼上有人说的对10K以上的话，要用电转化法，或买高效的转化态细胞。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
l*a
44 楼
顶礼膜拜一下，幸好你不是我师兄，不然得走多少弯路。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
d*i
45 楼
既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
收回我说的吧。对不起大家了。
我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
再次对大家表示对不起！
收回我说的吧。对不起大家了。
我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
再次对大家表示对不起！
m*z
46 楼
信息量太少了。载体CIP了吗？什么酶切位点？什么载体？酶切鉴定怎么不对？可能性
太多啦。
我做过9kb+9kb的平末端连接，PUC vector和lentiviral vector都做过，转的是自己做
的感受态，都没有问题。载体要CIP干净，连接要过夜，比例1:1左右。其他没有了。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
太多啦。
我做过9kb+9kb的平末端连接，PUC vector和lentiviral vector都做过，转的是自己做
的感受态，都没有问题。载体要CIP干净，连接要过夜，比例1:1左右。其他没有了。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
m*z
47 楼
又是一个。。。克隆不是自己想要的，到底怎么不是？即使是失败的实验也可以告诉你
很多东西的。
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
很多东西的。
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
z*1
48 楼
问题解决了么？
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
s*i
49 楼
我挺你，我经常做三段连，成功率非常高；有两次做过四段连，虽然得到我想要的，但
是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 d****i 的大作中提到】
: 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
: 收回我说的吧。对不起大家了。
: 我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
: 同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
: 再次对大家表示对不起！
是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
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【在 d****i 的大作中提到】
: 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
: 收回我说的吧。对不起大家了。
: 我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
: 同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
: 再次对大家表示对不起！
s*i
50 楼
为什么说做三段连就不懂分子克隆原理？
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【在 y******s 的大作中提到】
: 原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
: 可以提高成功率
: 我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 y******s 的大作中提到】
: 原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
: 可以提高成功率
: 我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
b*2
51 楼
做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
s*s
52 楼
长波uv
l*1
53 楼
Mark.
【在 b***2 的大作中提到】
: 做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
: 当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
: 2.16度过夜连接
: 3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
【在 b***2 的大作中提到】
: 做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
: 当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
: 2.16度过夜连接
: 3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
i*l
54 楼
i agree these, am using these tricks myself and efficiency is higher.
1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接(16c >=4hr , at least)
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺 (i usually recover for 2hr)
【在 b***2 的大作中提到】
: 做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
: 当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
: 2.16度过夜连接
: 3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接(16c >=4hr , at least)
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺 (i usually recover for 2hr)
【在 b***2 的大作中提到】
: 做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
: 当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
: 2.16度过夜连接
: 3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
g*3
55 楼
如果insert和backbone大小一样，我试过1：1的ratio，成功率比较高。。。。
C*n
56 楼
不知道你解决了没有。
昨天做了一个类似的，只不过我是5k + 5k
I assume 你gel extraction是干净彻底的
我用的molar ratio 是1:1，我不知道你为什么要用3:1或者其他的。为什么一定要认定
一个是insert，而另一个是plasmid呢，为什么不能换一下？
我用的是NEB的普通T4 DNA ligase， 连接1小时（普通的我一般是连接20min，也值按
照Protocol上说的），因为片段比较大。
I assume 你的感受态是没有问题的。
最后我提醒一下你，有时候酶切验证会失败，原因是不你克隆失败，而是其他原因，比
如甲基化。
Touble-shooting一下，不要漫天考虑太多的因素。
Hope it helps.
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
昨天做了一个类似的，只不过我是5k + 5k
I assume 你gel extraction是干净彻底的
我用的molar ratio 是1:1，我不知道你为什么要用3:1或者其他的。为什么一定要认定
一个是insert，而另一个是plasmid呢，为什么不能换一下？
我用的是NEB的普通T4 DNA ligase， 连接1小时（普通的我一般是连接20min，也值按
照Protocol上说的），因为片段比较大。
I assume 你的感受态是没有问题的。
最后我提醒一下你，有时候酶切验证会失败，原因是不你克隆失败，而是其他原因，比
如甲基化。
Touble-shooting一下，不要漫天考虑太多的因素。
Hope it helps.
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
m*r
57 楼
进来学习一下，
H*a
58 楼
我也常用三片段链接，效果都不错。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我挺你，我经常做三段连，成功率非常高；有两次做过四段连，虽然得到我想要的，但
: 是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
: 人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我挺你，我经常做三段连，成功率非常高；有两次做过四段连，虽然得到我想要的，但
: 是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
: 人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
m*t
59 楼
克隆做出来了吗？如果还没有，查查是什么载体，如果是ＲＥＴＲＯＶＩＲＵＳ ＶＥ
ＣＴＯＲ就比较讨厌。谁有什么好办法，给俺也说说。俺想插一段四ＫＢ的片段进ＰＭ
ＸＳ－ＧＦＰ载体，后来没做成就算了。
ＣＴＯＲ就比较讨厌。谁有什么好办法，给俺也说说。俺想插一段四ＫＢ的片段进ＰＭ
ＸＳ－ＧＦＰ载体，后来没做成就算了。
a*a
60 楼
我这么做出来过…
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
n*k
61 楼
最近经常做差不多大小的片段连接，可以参考下我的条件
1.载体去磷酸化
2.高效率感受态细胞
3.insert:vector大概6:1-9:1
4.足够的DNA，我10ul体系里面大概加100ng
5.我用NEB的连接酶，一般连接RT放一个小时
6.酶切时间不要太长，1-3小时+0.5-1小时载体去磷酸化
7.不要太相信酶切鉴定，我有一个载体，重做了2次，每次酶切位点都突变，可以连进
去，但是切不出来了，建议lz做PCR鉴定之后送测序。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
1.载体去磷酸化
2.高效率感受态细胞
3.insert:vector大概6:1-9:1
4.足够的DNA，我10ul体系里面大概加100ng
5.我用NEB的连接酶，一般连接RT放一个小时
6.酶切时间不要太长，1-3小时+0.5-1小时载体去磷酸化
7.不要太相信酶切鉴定，我有一个载体，重做了2次，每次酶切位点都突变，可以连进
去，但是切不出来了，建议lz做PCR鉴定之后送测序。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
f*u
62 楼
不明白为什么好几个人都说vector和insert大小差不多就不好连，这个有什么讲究吗？
我好像从没注意到有什么区别
我好像从没注意到有什么区别
x*e
63 楼
看来做cloning 的人还真不少，其实我建议不要纠结于连接了。设计PCR得到5+5=10kb
的片段，注意设计引物的时候5端磷酸化修饰，然后直接T4 ligase连接 10 kb的片段，
相当于自连，容易很多，PCR酶可以用NEB的fusion，说明书上说可以扩增22kb的片段。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
的片段，注意设计引物的时候5端磷酸化修饰，然后直接T4 ligase连接 10 kb的片段，
相当于自连，容易很多，PCR酶可以用NEB的fusion，说明书上说可以扩增22kb的片段。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
C*S
64 楼
刚做了一个retroviral plasmid，5k的载体，6k的基因，大概1：1比例，室温连接6个
小时，转化top10，筛了几个克隆，全都对。不知道你的问题出在哪里。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
小时，转化top10，筛了几个克隆，全都对。不知道你的问题出在哪里。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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