如何得到长度100氨基酸的多肽/蛋白质 - 未名空间MITBBS历史存档

如何得到长度100氨基酸的多肽/蛋白质# Biology - 生物学

i*a2014-03-13 07:03

1 楼

劉備在洞房花燭夜當晚，笑淫淫的對著嬌妻說：「該是老二出場的時候了 … … 」
此時關羽自外破門而入，大喊：「多謝大哥！」轉向新娘子：美人，讓你見識見識我
小弟弟的利害
話音未落，張飛破窗而入:謝謝二哥
”这时一阵怪风刮过，花烛熄灭，张飞提枪欲入却看不见洞穴所在，遂喊来刘备：“大
哥，屋内太黑，无孔可入
”刘备提一灯笼递去，说道：“孔明，孔明了。”
话音刚落，军师手拿芭蕉扇从天而降，大喊到："多谢主公. 微臣已在這裡等待多時,
血脈膨張, 那裏已經漲得紅得發紫! 把燈籠拿來, 大家來照紫龍..."
忽聽門外一聲馬嘶, 見趙雲騎馬奔來, 說: "末將來領軍師令旗, 現在就下馬操!"
突然平西將軍馬超奪門而入, 興奮的喊: "終輪到我來操操了!
床底一人撫掌大笑, "我曹孟德早聽說新劉夫人是女中鳳凰, 美如天仙, 今天讓我見識
見識這位女鳳仙..."
吕布放下方天畫戟, 進入房間. 眾觀之, 好不神勇!
劉夫人看到滿房間的英雄豪傑, 微笑者說: "今天洞房花燭夜, 有各路英雄的大蕉小蕉跟我一
起過, 我好生歡喜!"
屏風後傳出兩女子娇滴滴嘻笑聲, 一對妙齡少女走出來, "夫人原來早就知道大喬小喬
躲在這裡..."

j*j2014-03-13 07:03

2 楼

好像可以化学合成，大于$1000
可以用E coli system 表达，试了IMPACT™ Kit from New England Biolabs (因
为我们要native sequence的蛋白质---没有任何tag)，效果不是很好，得到的蛋白很少。
请问有没有人用过其他的体系表达native sequence的蛋白质啊？还有什么更好的方法
吗？
十分感谢！！

c*72014-03-13 07:03

3 楼

哇。。。不一样的三国。。。。。

i*l2014-03-13 07:03

4 楼

100Aa 不短了完全可以体外表达春花
原核还是真和或者古细菌的？原核用原核系统真和就用真和系统比如酵母，HEk，昆
虫杆状病毒等等古细菌大概就用Ecoli就好了
如果是从稀奇古怪的物种来的，可能AT高或GC高，需要先做ORF 优化

少。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 好像可以化学合成，大于$1000
: 可以用E coli system 表达，试了IMPACT™ Kit from New England Biolabs (因
: 为我们要native sequence的蛋白质---没有任何tag)，效果不是很好，得到的蛋白很少。
: 请问有没有人用过其他的体系表达native sequence的蛋白质啊？还有什么更好的方法
: 吗？
: 十分感谢！！

t*n2014-03-13 07:03

5 楼

ft

【在 i****a 的大作中提到】

: 劉備在洞房花燭夜當晚，笑淫淫的對著嬌妻說：「該是老二出場的時候了 … … 」
: 此時關羽自外破門而入，大喊：「多謝大哥！」轉向新娘子：美人，讓你見識見識我
: 小弟弟的利害
: 話音未落，張飛破窗而入:謝謝二哥
: ”这时一阵怪风刮过，花烛熄灭，张飞提枪欲入却看不见洞穴所在，遂喊来刘备：“大
: 哥，屋内太黑，无孔可入
: ”刘备提一灯笼递去，说道：“孔明，孔明了。”
: 话音刚落，军师手拿芭蕉扇从天而降，大喊到："多谢主公. 微臣已在這裡等待多時,
: 血脈膨張, 那裏已經漲得紅得發紫! 把燈籠拿來, 大家來照紫龍..."
: 忽聽門外一聲馬嘶, 見趙雲騎馬奔來, 說: "末將來領軍師令旗, 現在就下馬操!"

j*j2014-03-13 07:03

6 楼

谢谢您的回复！！！
我们这个蛋白确实是稀奇古怪的，因为是我们全新设计的氨基酸序列，所以才不知道用
什么体系表达。。。
还有一个问题是，我们要native sequence的蛋白，不要任何的tag。。。还有我们要的
蛋白不是Met开始的。。。

【在 i***l 的大作中提到】

: 100Aa 不短了完全可以体外表达春花
: 原核还是真和或者古细菌的？原核用原核系统真和就用真和系统比如酵母，HEk，昆
: 虫杆状病毒等等古细菌大概就用Ecoli就好了
: 如果是从稀奇古怪的物种来的，可能AT高或GC高，需要先做ORF 优化
:
: 少。

a*e2014-03-13 07:03

7 楼

这个更给力

e*s2014-03-13 07:03

8 楼

加几个氨基酸有很大影响吗？
否则就加tag，然后切掉。不管怎么弄，要表达纯化都会有额外的氨基酸。
还有个问题，提纯的话，如何检测，有抗体吗？有测活方法吗？
如果真是你说的那么严格，连Met都不能有，什么都不能加，就只能合成。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 谢谢您的回复！！！
: 我们这个蛋白确实是稀奇古怪的，因为是我们全新设计的氨基酸序列，所以才不知道用
: 什么体系表达。。。
: 还有一个问题是，我们要native sequence的蛋白，不要任何的tag。。。还有我们要的
: 蛋白不是Met开始的。。。

i*a2014-03-13 07:03

9 楼

IMHO, LZ 用舊的笑話原創的下面非常好 (孔明出場開始), 此貼可毛.
just IMHO

m*u2014-03-13 07:03

10 楼

一班搞生物的在给搞化学的解答。会问很傻的问题：为什么一个氨基酸都不能加，为什
么连Met都不能有？
还有：in vitro translation都没想到，真不像是搞生物的人在解答。
当然了，这个Met都不能有，只有合成了。连加tag再切除都不能保证：1）有合适切点
，2）能不出错。
体内表达的一般是会切除起始Met的，但 1）不能保证，也有没切除的；2）不能保证只
切除Met，也有多切一两个氨基酸的。
LZ这么严格，我怀疑体外合成的产品能否保证均一！

j*n2014-03-13 07:03

11 楼

我觉得还可以把叼馋加进去。

j*j2014-03-13 07:03

12 楼

加氨基酸影响很大，因为我们设计的氨基酸序列要折叠成精确的三维结构，所以任何序
列改变都有很大的影响。所以我们试了IMPACT™ Kit from New England Biolabs
，这个kit可以给我们精确的氨基酸序列。
我们不知到如何检测，没有抗体，我们的蛋白没有活性，我们要的是她的结构。我们的
终极目标是得到X-ray的结构。（虽然目标比较遥远）

【在 e****s 的大作中提到】

: 加几个氨基酸有很大影响吗？
: 否则就加tag，然后切掉。不管怎么弄，要表达纯化都会有额外的氨基酸。
: 还有个问题，提纯的话，如何检测，有抗体吗？有测活方法吗？
: 如果真是你说的那么严格，连Met都不能有，什么都不能加，就只能合成。

j*j2014-03-13 07:03

13 楼

我们试了IMPACT™ Kit，可以得到想要的氨基酸序列（没有任何tag，不用从Met
开始）。但是得率不好。
有个 PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit，但是不知到这个好不好
用？听说in vitro大多时候都不好用。

【在 m******u 的大作中提到】

: 一班搞生物的在给搞化学的解答。会问很傻的问题：为什么一个氨基酸都不能加，为什
: 么连Met都不能有？
: 还有：in vitro translation都没想到，真不像是搞生物的人在解答。
: 当然了，这个Met都不能有，只有合成了。连加tag再切除都不能保证：1）有合适切点
: ，2）能不出错。
: 体内表达的一般是会切除起始Met的，但 1）不能保证，也有没切除的；2）不能保证只
: 切除Met，也有多切一两个氨基酸的。
: LZ这么严格，我怀疑体外合成的产品能否保证均一！

s*s2014-03-13 07:03

14 楼

发现大家很催悲啊。也就$1000多，你自己从克隆做起到蛋白表达，纯化，
不算试剂前，就算浪费的时间也不止这个钱啊，这还是假设做的顺利的

少。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 好像可以化学合成，大于$1000
: 可以用E coli system 表达，试了IMPACT™ Kit from New England Biolabs (因
: 为我们要native sequence的蛋白质---没有任何tag)，效果不是很好，得到的蛋白很少。
: 请问有没有人用过其他的体系表达native sequence的蛋白质啊？还有什么更好的方法
: 吗？
: 十分感谢！！

m*u2014-03-13 07:03

15 楼

做化学的还只能用水（或含少量甲醇）来溶解蛋白，这一点也让搞生物的很恼怒，总觉
得在（体外的）水里蛋白能行吗？至少的有buffer，有甘油吧？！有平衡盐离子吧。

T*t2014-03-13 07:03

16 楼

100aa的多肽合成$1000的话不算贵了。普通的catalog可订的多肽，20aa左右的长度也
要两百多了。customized的多肽一般都比这个价要贵很多。
我有次问一个公司要了个quote，只有20个aa的多肽，但是要有Ubiquitination，所以
加起来也有将近100aa了吧。对方开价$5000多。老板直接就无视了，最后那个project
就没做。

少。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 好像可以化学合成，大于$1000
: 可以用E coli system 表达，试了IMPACT™ Kit from New England Biolabs (因
: 为我们要native sequence的蛋白质---没有任何tag)，效果不是很好，得到的蛋白很少。
: 请问有没有人用过其他的体系表达native sequence的蛋白质啊？还有什么更好的方法
: 吗？
: 十分感谢！！

m*u2014-03-13 07:03

17 楼

自己表达可以拿到很多啊，且反复可用，合成可是是一次性的，如果用完了，课题还没
完成岂不是要double cost。自己表达，这重复再纯化一些，cost小很多啊。

e*s2014-03-13 07:03

18 楼

好奇，专门研究了这个impact系统。不管怎样，都会有额外的氨基酸。
其实就是去除tag特别点。我如果理解得对，你的tag在c-term,那Met总在目标蛋白上吧
。你克要有额外的DNA 序列加内切位点吧？没法得到你说的native sequence啊。
不知道我理解得对不？

少。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 好像可以化学合成，大于$1000
: 可以用E coli system 表达，试了IMPACT™ Kit from New England Biolabs (因
: 为我们要native sequence的蛋白质---没有任何tag)，效果不是很好，得到的蛋白很少。
: 请问有没有人用过其他的体系表达native sequence的蛋白质啊？还有什么更好的方法
: 吗？
: 十分感谢！！

M*g2014-03-13 07:03

19 楼

you can assemble a sequence like this: met-flag tag (DYKDDDDK)- your peptide
. express it in a host like e. coli. Purify the flag-your peptide. you
then use enterokinase to cut off flag tag and leave your peptide with no
scar and no met, since enterokinase recognize DDDDK, and cut after the last
K (you can find more information at NEB: https://www.neb.com/products/p8070-
enterokinase-light-chain).
hope this helps. good luck.

g*12014-03-13 07:03

20 楼

可以试试SUMO Expression System。这样既可以用Histag 纯化，也可以用Sumo
protease把fused sumo蛋白完全切除
http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/sumo_prot
http://lucigen.com/docs/manuals/MA108-Expresso-T7-SUMO-Cloning-

s*y2014-03-13 07:03

21 楼

我也正想说这个呢。
可以在N-端放Ubiquitin sequence（和SUMO是一样的道理）, 然后后面放楼主要用的序
列，然后如果在真核里表达的话，Ubiquitin 可以直接被细胞里的酶切除，就露出后面
的氨基酸了，这样就不需要从Met 开始了。而且这种方法在理论上不会影响后面跟着的
多肽的折叠。但是要注意的是这种方法不能做出Pro开头的多肽，因为会切不掉。
如果是在细菌里表达的话，既可以同时表达一个ubiquitin hydrolase,也可以纯化之后
再和ubiquitin hydrolase反应。如果要求纯度更高的话，还可以用anti-ubiquitin 来
除去没有切掉的蛋白。

【在 g*****1 的大作中提到】

: 可以试试SUMO Expression System。这样既可以用Histag 纯化，也可以用Sumo
: protease把fused sumo蛋白完全切除
: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/sumo_prot
: http://lucigen.com/docs/manuals/MA108-Expresso-T7-SUMO-Cloning-

j*j2014-03-13 07:03

22 楼

完全同意您的观点。。。。

【在 s******s 的大作中提到】

: 发现大家很催悲啊。也就$1000多，你自己从克隆做起到蛋白表达，纯化，
: 不算试剂前，就算浪费的时间也不止这个钱啊，这还是假设做的顺利的
:
: 少。

j*j2014-03-13 07:03

23 楼

同意，如果要大规模的生产蛋白，还是用细菌表达便宜。
但是如果只是试验想法，还是合成来的简单。

【在 m******u 的大作中提到】

: 自己表达可以拿到很多啊，且反复可用，合成可是是一次性的，如果用完了，课题还没
: 完成岂不是要double cost。自己表达，这重复再纯化一些，cost小很多啊。

s*s2014-03-13 07:03

24 楼

非也。大规模也是合成便宜，除非有特别结构的。
国内蛋白质合成也太便宜了。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 同意，如果要大规模的生产蛋白，还是用细菌表达便宜。
: 但是如果只是试验想法，还是合成来的简单。

T*u2014-03-13 07:03

25 楼

显然不是这样的。
Met-His/or other tag-Ub-your protein
表达出来之后用合适的DUB把Ub切掉
最后得到任何amino acid开头的多肽。
不许瞧不起学生物的。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。

【在 m******u 的大作中提到】

: 一班搞生物的在给搞化学的解答。会问很傻的问题：为什么一个氨基酸都不能加，为什
: 么连Met都不能有？
: 还有：in vitro translation都没想到，真不像是搞生物的人在解答。
: 当然了，这个Met都不能有，只有合成了。连加tag再切除都不能保证：1）有合适切点
: ，2）能不出错。
: 体内表达的一般是会切除起始Met的，但 1）不能保证，也有没切除的；2）不能保证只
: 切除Met，也有多切一两个氨基酸的。
: LZ这么严格，我怀疑体外合成的产品能否保证均一！

o*u2014-03-13 07:03

26 楼

这有什么，完全不用水都可以。
用纯有机溶剂，完全无水的酶催化项目也有投产的。

【在 m******u 的大作中提到】

: 做化学的还只能用水（或含少量甲醇）来溶解蛋白，这一点也让搞生物的很恼怒，总觉
: 得在（体外的）水里蛋白能行吗？至少的有buffer，有甘油吧？！有平衡盐离子吧。

o*u2014-03-13 07:03

27 楼

这个和结构长度关系很大。
大蛋白一般是生物表达的便宜。一般的常用工业蛋白大宗报价是5-10美元一公斤。
小蛋白50aa以下是化学合成便宜。大宗报价是100000美元一公斤。
中间长度的就看结构了。
100aa的是比较难搞的长度。说长不长，说短不短的。

【在 s******s 的大作中提到】

: 非也。大规模也是合成便宜，除非有特别结构的。
: 国内蛋白质合成也太便宜了。

o*u2014-03-13 07:03

28 楼

谨慎猜测你们是不是刚开始做de novo design？如果你们是业界大牛，请原谅我的唐突。
de novo design预测出来的结构，最后表达不出来的，或者折叠不了的，可以说是十有
八九。只是这样的nagative result是发不出来文章的，所以外行看了几篇N/S文章，会
有结构预测已经很成熟的错觉。比较稳妥的做法，还是要参考自然中已经存在的蛋白，
最好是结构已经测定的蛋白来做骨架，然后再通过计算修正。100aa的小蛋白或者长多
肽的折叠已经非常复杂，如果没有homologues,几乎不可能直接准确预测。
另外，de novo design很大程度是依靠统计意义的成功。一般要有上百个预测的结构，
然后在实验室做筛选。最终序列还要做上数轮的定向进化修正。只设计一个序列，然后
就运气好爆直接成功的，我是没见过。
如果有公司在1000美元提供高质量（>80%纯度）的100aa的多肽，我建议你们直接定，
这个价格非常便宜。如果你们想继续试生物表达，除了前面的建议外，你还可以试试
Profinity eXact purification kit.这个系统无需添加额外蛋白酶，加tag表达，提纯
后直接得到切割后的产物，没有额外的氨基酸。
最后，祝你好运。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 谢谢您的回复！！！
: 我们这个蛋白确实是稀奇古怪的，因为是我们全新设计的氨基酸序列，所以才不知道用
: 什么体系表达。。。
: 还有一个问题是，我们要native sequence的蛋白，不要任何的tag。。。还有我们要的
: 蛋白不是Met开始的。。。

j*j2014-03-13 07:03

29 楼

如果要试验很多氨基酸序列的话，每个序列$1000，也可以无视了。

project

【在 T**********t 的大作中提到】

: 100aa的多肽合成$1000的话不算贵了。普通的catalog可订的多肽，20aa左右的长度也
: 要两百多了。customized的多肽一般都比这个价要贵很多。
: 我有次问一个公司要了个quote，只有20个aa的多肽，但是要有Ubiquitination，所以
: 加起来也有将近100aa了吧。对方开价$5000多。老板直接就无视了，最后那个project
: 就没做。
:
: 少。

j*j2014-03-13 07:03

30 楼

impact kit 的确可以得到native sequence, 酶切位点可以是c-term，或n-term，酶切
效率和末端氨基酸有关。。。
见下面链接
https://www.neb.com/products/e6901-impact-kit

【在 e****s 的大作中提到】

: 好奇，专门研究了这个impact系统。不管怎样，都会有额外的氨基酸。
: 其实就是去除tag特别点。我如果理解得对，你的tag在c-term,那Met总在目标蛋白上吧
: 。你克要有额外的DNA 序列加内切位点吧？没法得到你说的native sequence啊。
: 不知道我理解得对不？
:
: 少。

j*j2014-03-13 07:03

31 楼

This is very helpful! Thanks so much!

peptide
last
p8070-

【在 M******g 的大作中提到】

: you can assemble a sequence like this: met-flag tag (DYKDDDDK)- your peptide
: . express it in a host like e. coli. Purify the flag-your peptide. you
: then use enterokinase to cut off flag tag and leave your peptide with no
: scar and no met, since enterokinase recognize DDDDK, and cut after the last
: K (you can find more information at NEB: https://www.neb.com/products/p8070-
: enterokinase-light-chain).
: hope this helps. good luck.

j*j2014-03-13 07:03

32 楼

十分感谢！！！！

【在 g*****1 的大作中提到】

: 可以试试SUMO Expression System。这样既可以用Histag 纯化，也可以用Sumo
: protease把fused sumo蛋白完全切除
: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/sumo_prot
: http://lucigen.com/docs/manuals/MA108-Expresso-T7-SUMO-Cloning-

o*u2014-03-13 07:03

33 楼

de novo design本来就是烧钱的东西。不然全世界也不会只有几个地方能做了。
如果你自己表达，基因合成的费用也是要那么多的。
我们一般一个蛋白设计的项目，前期基因设计/合成的的预算就要准备150000美元左右
，做大概一百个左右的设计。大学的实验室自己做可能比较吃力，但是商业项目的话，
这个只相当于一个人头一年的开支。考虑到节约的时间，还是很划算的。
当然，要是你们搞了什么逆天的牛算法出来，可以一次预测成功的，当我什么都没说，
我等着读你们的文章。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 如果要试验很多氨基酸序列的话，每个序列$1000，也可以无视了。
:
: project

A*y2014-03-13 07:03

34 楼

Clearly you are not a peptide chemist. Synthetic peptide limits are around
50 amino acid residues if you are lucky. Expression system is a lot better.

【在 s******s 的大作中提到】

: 非也。大规模也是合成便宜，除非有特别结构的。
: 国内蛋白质合成也太便宜了。

j*j2014-03-13 07:03

35 楼

你的猜测完全正确！！我们就是做de novo design的，不过不是什么大牛，但是有一定
的基础。你的评价很中肯，我完全同意你的观点！
de novo design的难点就是，你不知道你设计的氨基酸序列可不可以折叠成你设计的结
构（或者，我们根本就不知道，什么结构我们可以设计，或者说，给定一个结构，我们
不知道可不可能找到一个氨基酸序列），现在的大牛实验室（David Baker超级大牛）
发N/S，也要试很多序列，才能成功一次。完全同意，结构预测还远远没有成熟。不过
如果只是用同源蛋白，只改变几个氨基酸，可以改变蛋白质的性质。但是我们要做的是
设计全新的蛋白质结构（确实，这个目标太遥远了。。。）。
谢谢您的这些很好的建议！如果只是统计意义的成功，试很多序列才成功一次，其实我
们并没有找到规律。只有每个设计的序列都会成功，才是真正的科学规律。
十分感谢您提供的Profinity eXact purification kit的信息！对我们很有帮助。

突。

【在 o****u 的大作中提到】

: 谨慎猜测你们是不是刚开始做de novo design？如果你们是业界大牛，请原谅我的唐突。
: de novo design预测出来的结构，最后表达不出来的，或者折叠不了的，可以说是十有
: 八九。只是这样的nagative result是发不出来文章的，所以外行看了几篇N/S文章，会
: 有结构预测已经很成熟的错觉。比较稳妥的做法，还是要参考自然中已经存在的蛋白，
: 最好是结构已经测定的蛋白来做骨架，然后再通过计算修正。100aa的小蛋白或者长多
: 肽的折叠已经非常复杂，如果没有homologues,几乎不可能直接准确预测。
: 另外，de novo design很大程度是依靠统计意义的成功。一般要有上百个预测的结构，
: 然后在实验室做筛选。最终序列还要做上数轮的定向进化修正。只设计一个序列，然后
: 就运气好爆直接成功的，我是没见过。
: 如果有公司在1000美元提供高质量（>80%纯度）的100aa的多肽，我建议你们直接定，

j*j2014-03-13 07:03

36 楼

很同意你的观点，de novo design的关键部分是计算机的算法和我们对蛋白质折叠的认
识，如果我们能让计算方法更准确一些，de novo design就会变得不那么烧钱了，大家
就可以一起玩了。
好像David Baker在做公司，不知道这个方向商业上的做的怎么样了？希望大家能把这
个方向做大。

【在 o****u 的大作中提到】

: de novo design本来就是烧钱的东西。不然全世界也不会只有几个地方能做了。
: 如果你自己表达，基因合成的费用也是要那么多的。
: 我们一般一个蛋白设计的项目，前期基因设计/合成的的预算就要准备150000美元左右
: ，做大概一百个左右的设计。大学的实验室自己做可能比较吃力，但是商业项目的话，
: 这个只相当于一个人头一年的开支。考虑到节约的时间，还是很划算的。
: 当然，要是你们搞了什么逆天的牛算法出来，可以一次预测成功的，当我什么都没说，
: 我等着读你们的文章。

s*s2014-03-13 07:03

37 楼

你要考虑N-end rule，不然体内做的话会有问题的

【在 j*********j 的大作中提到】

: 谢谢您的回复！！！
: 我们这个蛋白确实是稀奇古怪的，因为是我们全新设计的氨基酸序列，所以才不知道用
: 什么体系表达。。。
: 还有一个问题是，我们要native sequence的蛋白，不要任何的tag。。。还有我们要的
: 蛋白不是Met开始的。。。

s*y2014-03-13 07:03

38 楼

其实我倒是想，你们能不能在表达的地方用不同序列做一个库，然后最后看哪个方法做
出来的能够成功折叠了成你们预测的构型？

【在 j*********j 的大作中提到】

: 你的猜测完全正确！！我们就是做de novo design的，不过不是什么大牛，但是有一定
: 的基础。你的评价很中肯，我完全同意你的观点！
: de novo design的难点就是，你不知道你设计的氨基酸序列可不可以折叠成你设计的结
: 构（或者，我们根本就不知道，什么结构我们可以设计，或者说，给定一个结构，我们
: 不知道可不可能找到一个氨基酸序列），现在的大牛实验室（David Baker超级大牛）
: 发N/S，也要试很多序列，才能成功一次。完全同意，结构预测还远远没有成熟。不过
: 如果只是用同源蛋白，只改变几个氨基酸，可以改变蛋白质的性质。但是我们要做的是
: 设计全新的蛋白质结构（确实，这个目标太遥远了。。。）。
: 谢谢您的这些很好的建议！如果只是统计意义的成功，试很多序列才成功一次，其实我
: 们并没有找到规律。只有每个设计的序列都会成功，才是真正的科学规律。

j*j2014-03-13 07:03

39 楼

你的意思是不是，我们做一个蛋白质序列的库，然后用它做训练集，来建立或者测试新
的计算方法？
蛋白质结构数据库（PDB）就是一个很好的库，有90K+的蛋白质结构，我们可以充分利
用PDB里面的信息，来提高我们蛋白质结构预测和设计的精度。（虽然已经有很多人开
展了这方面的工作，但是PDB里面的隐藏信息还很多，而且PDB正在快速的增长）。

【在 s******y 的大作中提到】

: 其实我倒是想，你们能不能在表达的地方用不同序列做一个库，然后最后看哪个方法做
: 出来的能够成功折叠了成你们预测的构型？

s*y2014-03-13 07:03

40 楼

差不多，就是做一个de novo expression 的库，看看哪个能够成功的表达以及折叠。
因为不是每一个序列都能表达出来的。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 你的意思是不是，我们做一个蛋白质序列的库，然后用它做训练集，来建立或者测试新
: 的计算方法？
: 蛋白质结构数据库（PDB）就是一个很好的库，有90K+的蛋白质结构，我们可以充分利
: 用PDB里面的信息，来提高我们蛋白质结构预测和设计的精度。（虽然已经有很多人开
: 展了这方面的工作，但是PDB里面的隐藏信息还很多，而且PDB正在快速的增长）。

o*u2014-03-13 07:03

41 楼

现在预测的瓶颈不在算法，而是电脑科技发展速度太慢了，即使是大型的cluster也不
行。
我所知道的主流预测算法都是不含水的。包括rosetta都是完全不含水的干蛋白计算。
如果需要加入水分子的计算，现在的电脑运算速度还需要提高至少数千万倍（一个蛋白
含100个水分子，每个水分子按照XYZ轴每5度角的旋转计算一次能量）。
按照摩尔定律18个月速度提高一倍的速度，我退休之前是看不到那一天了。
我个人认为de novo design本身在可以预见的将来是没有什么商业价值的。但是从中衍
生出来的很多方法学是可以应用到实际工作中的。大致可以比喻为有机合成中的全合成
，本身没什么用，但是其中某些步骤可以应用到大规模化工生产中。

【在 j*********j 的大作中提到】

: 你的猜测完全正确！！我们就是做de novo design的，不过不是什么大牛，但是有一定
: 的基础。你的评价很中肯，我完全同意你的观点！
: de novo design的难点就是，你不知道你设计的氨基酸序列可不可以折叠成你设计的结
: 构（或者，我们根本就不知道，什么结构我们可以设计，或者说，给定一个结构，我们
: 不知道可不可能找到一个氨基酸序列），现在的大牛实验室（David Baker超级大牛）
: 发N/S，也要试很多序列，才能成功一次。完全同意，结构预测还远远没有成熟。不过
: 如果只是用同源蛋白，只改变几个氨基酸，可以改变蛋白质的性质。但是我们要做的是
: 设计全新的蛋白质结构（确实，这个目标太遥远了。。。）。
: 谢谢您的这些很好的建议！如果只是统计意义的成功，试很多序列才成功一次，其实我
: 们并没有找到规律。只有每个设计的序列都会成功，才是真正的科学规律。

p*s2014-03-13 07:03

42 楼

这问题在这个版上需要讨论这么久？在中国的CRO一个有经验的硕士生本科生分分钟搞
定。
加一个利于蛋白溶解的标签，然后中间加一个酶切位点，不残留氨
基酸。问题也许是蛋白会不会正确折叠，但总比纠结这种初级问题好...原谅我的措词
，哈哈

【在 j*********j 的大作中提到】

: This is very helpful! Thanks so much!
:
: peptide
: last
: p8070-

p*s2014-03-13 07:03

43 楼

100个氨基酸的多肽基本合成不出来...而且怎么保证结构正确呢，HPLC纯化的

突。

【在 o****u 的大作中提到】

: 谨慎猜测你们是不是刚开始做de novo design？如果你们是业界大牛，请原谅我的唐突。
: de novo design预测出来的结构，最后表达不出来的，或者折叠不了的，可以说是十有
: 八九。只是这样的nagative result是发不出来文章的，所以外行看了几篇N/S文章，会
: 有结构预测已经很成熟的错觉。比较稳妥的做法，还是要参考自然中已经存在的蛋白，
: 最好是结构已经测定的蛋白来做骨架，然后再通过计算修正。100aa的小蛋白或者长多
: 肽的折叠已经非常复杂，如果没有homologues,几乎不可能直接准确预测。
: 另外，de novo design很大程度是依靠统计意义的成功。一般要有上百个预测的结构，
: 然后在实验室做筛选。最终序列还要做上数轮的定向进化修正。只设计一个序列，然后
: 就运气好爆直接成功的，我是没见过。
: 如果有公司在1000美元提供高质量（>80%纯度）的100aa的多肽，我建议你们直接定，