[求助]与蛋白质结合的DNA的提纯方法,前提是不能去除或变性结合的蛋白# Biology - 生物学z*b2014-04-11 07:041 楼与蛋白质结合的DNA用酶处理后需提纯。难点在于结合的蛋白质不能去除,蛋白不能变性,这样就不能用phenol/chloroform或spin column的方法了。请教各位有没有简单可行的方法,在下先行谢过了。
m*D2014-04-11 07:042 楼你是要纯化总个DNA-protein complex还是拆开complex就纯化DNA?一般DNA-protein结合,需要一定的盐浓度,高KCl浓度,象300mM就可以了。这是许多纯化DNA/RNAbinding protein,从affinity column上把蛋白里洗脱下来的条件。
z*b2014-04-11 07:043 楼感谢回帖。我要的是纯化总的DNA-protein complex(上面crosslink的蛋白不能去除,不能变性), 需要将酶和反应buffer里的成分都去除干净,还要求recovery的百分比较高,方法简单易行。望不吝赐教。【在 m*********D 的大作中提到】: 你是要纯化总个DNA-protein complex还是拆开complex就纯化DNA?一般DNA-protein结: 合,需要一定的盐浓度,高KCl浓度,象300mM就可以了。这是许多纯化DNA/RNA: binding protein,从affinity column上把蛋白里洗脱下来的条件。
s*y2014-04-11 07:044 楼能不能用 agarose-conjugated DNaseI把DNA消化掉?然后过一下一次性的柱子,就把DNaseI和小片断的DNA 都同时去掉了。【在 z**b 的大作中提到】: 与蛋白质结合的DNA用酶处理后需提纯。难点在于结合的蛋白质不能去除,蛋白不能变: 性,这样就不能用phenol/chloroform或spin column的方法了。请教各位有没有简单可: 行的方法,在下先行谢过了。
z*b2014-04-11 07:045 楼感谢回复。可惜我是要蛋白质和DNA都保留。【在 s******y 的大作中提到】: 能不能用 agarose-conjugated DNaseI把DNA消化掉?然后过一下一次性的柱子,就把: DNaseI和小片断的DNA 都同时去掉了。
d*i2014-04-11 07:046 楼你这个蛋白是已知的吗?如果是已知的,那么用这个蛋白的抗体(conjugated tobeads)和你的complex孵育一下,然后挂在磁性柱子上,杂蛋白洗掉。。。。。
s*y2014-04-11 07:047 楼这样的啊,我还以为你是想把蛋白质和DNA分开呢。那些经常做ChiP 的人应该有比较好的办法吧。比方说你应该可以用DEAE resin (positively charged) 来收集DNA啊。比方说QIAGEN Anion-Exchange Resin。相应的蛋白也会被留下来的。【在 z**b 的大作中提到】: 感谢回复。可惜我是要蛋白质和DNA都保留。
m*e2014-04-11 07:0410 楼对阿,不能过一个size exclusion的柱子么, 把小于10kd的都留在柱子里。【在 R******0 的大作中提到】: 不能一起过个gel filtration柱子?