CRISPR/ZFN/TALEN之前为什么不能用同源重组做细胞系knock out？# Biology - 生物学
V*t
1 楼
比如实验需要NIH3T3敲除某基因，能否用老鼠胚胎干细胞打靶的原理，做基因敲除呢？
怎么很少看到有人做这样的事情呢？
怎么很少看到有人做这样的事情呢？
j*n
2 楼
效率太低吧
一般低于1/1000，有的低于百万分之一
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【在 V******t 的大作中提到】
: 比如实验需要NIH3T3敲除某基因，能否用老鼠胚胎干细胞打靶的原理，做基因敲除呢？
: 怎么很少看到有人做这样的事情呢？
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l*a
3 楼
+1
【在 j****n 的大作中提到】
: 效率太低吧
: 一般低于1/1000，有的低于百万分之一
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r*g
4 楼
见过crispr KO cell line的
貌似不难做～ 不过没有深研究
不知道怎么解决off target的问题了... 并且，貌似没有很好的control
老鼠身上的off target在breeding的过程中，自动dilute out了
【在 V******t 的大作中提到】
: 比如实验需要NIH3T3敲除某基因，能否用老鼠胚胎干细胞打靶的原理，做基因敲除呢？
: 怎么很少看到有人做这样的事情呢？
貌似不难做～ 不过没有深研究
不知道怎么解决off target的问题了... 并且，貌似没有很好的control
老鼠身上的off target在breeding的过程中，自动dilute out了
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w*r
5 楼
大多数细胞系同源重组率非常非常低。ES细胞同源重组比较高。
可能和细胞dna修复的machinary有关。nhej 比较强,等等。
不同的转染方法也影响重组率，比如ES,普通转染的重组效率远低于电转
另外细胞系,比如 3t3,都是多倍体，而且没办法通过交配形成KO。
有rnai,很多时候没必要做Ko.
可能和细胞dna修复的machinary有关。nhej 比较强,等等。
不同的转染方法也影响重组率，比如ES,普通转染的重组效率远低于电转
另外细胞系,比如 3t3,都是多倍体，而且没办法通过交配形成KO。
有rnai,很多时候没必要做Ko.
x*e
6 楼
可以筛啊
【在 j****n 的大作中提到】
: 效率太低吧
: 一般低于1/1000，有的低于百万分之一
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s*y
7 楼
效率太低。别忘了染色体有两个。敲掉其中一个的几率大概是百万之一，敲掉两个的个
概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。
【在 V******t 的大作中提到】
: 比如实验需要NIH3T3敲除某基因，能否用老鼠胚胎干细胞打靶的原理，做基因敲除呢？
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概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。
【在 V******t 的大作中提到】
: 比如实验需要NIH3T3敲除某基因，能否用老鼠胚胎干细胞打靶的原理，做基因敲除呢？
: 怎么很少看到有人做这样的事情呢？
s*r
8 楼
关键是要把DNA搞断，之前在mES里做gene-targeting，要用很长很长的homology arm,
才有很低很低的概率正好在那个地方发生同源重组。现在可以先把DNA在那里先搞断，
同源重组的概率就高了上千倍
才有很低很低的概率正好在那个地方发生同源重组。现在可以先把DNA在那里先搞断，
同源重组的概率就高了上千倍
n*8
9 楼
做细胞line的比较少。
能拿到hom的概率低，另外,这些细胞系养了那么久了，核型估计都不太正常了。
能拿到hom的概率低，另外,这些细胞系养了那么久了，核型估计都不太正常了。
j*n
10 楼
那生物老博真的搬砖不如了。。。
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【在 x********e 的大作中提到】
: 可以筛啊
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【在 x********e 的大作中提到】
: 可以筛啊
l*e
11 楼
只有这个是正解.
PI博后高下立判。
【在 s******y 的大作中提到】
: 效率太低。别忘了染色体有两个。敲掉其中一个的几率大概是百万之一，敲掉两个的个
: 概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
: 对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。
PI博后高下立判。
【在 s******y 的大作中提到】
: 效率太低。别忘了染色体有两个。敲掉其中一个的几率大概是百万之一，敲掉两个的个
: 概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
: 对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。
r*g
12 楼
293T 不是有10-20%么？
是Church的paper里面么，有写啊
直接做CRISPR以后，然后 理论上做单细胞克隆，筛就能筛出来吧
只不过有点儿laborious
难道我理解错了？
我自己没做过，但是仔细研究过做过的protocol，nucleotide-to-nucleotide的比较
之前有个哥们人回帖说，homology arm要很长的，crispr的DNA oligo的homology arm
不需要很长
【在 s******y 的大作中提到】
: 效率太低。别忘了染色体有两个。敲掉其中一个的几率大概是百万之一，敲掉两个的个
: 概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
: 对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。
是Church的paper里面么，有写啊
直接做CRISPR以后，然后 理论上做单细胞克隆，筛就能筛出来吧
只不过有点儿laborious
难道我理解错了？
我自己没做过，但是仔细研究过做过的protocol，nucleotide-to-nucleotide的比较
之前有个哥们人回帖说，homology arm要很长的，crispr的DNA oligo的homology arm
不需要很长
【在 s******y 的大作中提到】
: 效率太低。别忘了染色体有两个。敲掉其中一个的几率大概是百万之一，敲掉两个的个
: 概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
: 对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。
r*g
13 楼
http://www.sciencemag.org/content/339/6121/823
我个人认为，比较难解决的还是off target的问题
KO老鼠身上的off target在breeding过程中 finally diluted out
但是一个single cell clone里面的off target就没办法了
【在 s******y 的大作中提到】
: 效率太低。别忘了染色体有两个。敲掉其中一个的几率大概是百万之一，敲掉两个的个
: 概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
: 对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。
我个人认为，比较难解决的还是off target的问题
KO老鼠身上的off target在breeding过程中 finally diluted out
但是一个single cell clone里面的off target就没办法了
【在 s******y 的大作中提到】
: 效率太低。别忘了染色体有两个。敲掉其中一个的几率大概是百万之一，敲掉两个的个
: 概率就更低了。要筛选很多细胞才能筛到一两个。
: 对于胚胎法，其实是先敲掉一个拷贝，然后弄成老鼠之后再交配一下弄出个纯合体来。
x*e
14 楼
药筛很简单吧？能活下来就是重组了的。不过sunnyday说的allele问题是关键，无解。
【在 j****n 的大作中提到】
: 那生物老博真的搬砖不如了。。。
:
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: 那生物老博真的搬砖不如了。。。
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r*g
15 楼
我完全混乱了
楼主说的这种情况，为什么需要药筛呢？
直接把 在 exon 或者 exon junction的 DNA double strand 用Cas9 break了，NHEJ不
就把target gene给敲了么
然后做单细胞克隆，然后再PCR筛，sequencing confirm，难道这样不是简单些么？
【在 x********e 的大作中提到】
: 药筛很简单吧？能活下来就是重组了的。不过sunnyday说的allele问题是关键，无解。
楼主说的这种情况，为什么需要药筛呢？
直接把 在 exon 或者 exon junction的 DNA double strand 用Cas9 break了，NHEJ不
就把target gene给敲了么
然后做单细胞克隆，然后再PCR筛，sequencing confirm，难道这样不是简单些么？
【在 x********e 的大作中提到】
: 药筛很简单吧？能活下来就是重组了的。不过sunnyday说的allele问题是关键，无解。
r*g
16 楼
你说的是把一个药筛的cassete knock in 到target gene locus里面去么？ 还是直接
用homologous recombination的办法，把基因替换？
这个用crispr难度很大的～
几十个nucleotides，比如一个loxp site之类的用crispr可以knock in，东西大了弄不
进去的...
【在 x********e 的大作中提到】
: 药筛很简单吧？能活下来就是重组了的。不过sunnyday说的allele问题是关键，无解。
用homologous recombination的办法，把基因替换？
这个用crispr难度很大的～
几十个nucleotides，比如一个loxp site之类的用crispr可以knock in，东西大了弄不
进去的...
【在 x********e 的大作中提到】
: 药筛很简单吧？能活下来就是重组了的。不过sunnyday说的allele问题是关键，无解。
r*g
17 楼
http://pnabio.com/products/KOCells.htm
你们看
Cell lines that we have generated knock-outs or knock-ins
HEK293 cells
HeLa cells (hypertriploid)
SKBR3 cells (hypertriploid)
HCT116 cells (diploid)
MCF7 cells (Hypotriploid)
K562 cells (hypotriploid)
CHO cells
NIH3T3 cells
We have successfully generated knock-out clones up to 4 copies in one round.
应该不难做吧
成功率应该不低，好想自己试一下
你们看
Cell lines that we have generated knock-outs or knock-ins
HEK293 cells
HeLa cells (hypertriploid)
SKBR3 cells (hypertriploid)
HCT116 cells (diploid)
MCF7 cells (Hypotriploid)
K562 cells (hypotriploid)
CHO cells
NIH3T3 cells
We have successfully generated knock-out clones up to 4 copies in one round.
应该不难做吧
成功率应该不低，好想自己试一下
s*y
18 楼
楼主说的是用那种做老鼠KO 的方法来做细胞，对，就是用那种１万多bp 长的质粒来做
，不是指CRISPR或者TALEN
arm
【在 r******g 的大作中提到】
: 293T 不是有10-20%么？
: 是Church的paper里面么，有写啊
: 直接做CRISPR以后，然后 理论上做单细胞克隆，筛就能筛出来吧
: 只不过有点儿laborious
: 难道我理解错了？
: 我自己没做过，但是仔细研究过做过的protocol，nucleotide-to-nucleotide的比较
: 之前有个哥们人回帖说，homology arm要很长的，crispr的DNA oligo的homology arm
: 不需要很长
，不是指CRISPR或者TALEN
arm
【在 r******g 的大作中提到】
: 293T 不是有10-20%么？
: 是Church的paper里面么，有写啊
: 直接做CRISPR以后，然后 理论上做单细胞克隆，筛就能筛出来吧
: 只不过有点儿laborious
: 难道我理解错了？
: 我自己没做过，但是仔细研究过做过的protocol，nucleotide-to-nucleotide的比较
: 之前有个哥们人回帖说，homology arm要很长的，crispr的DNA oligo的homology arm
: 不需要很长
s*y
19 楼
你过奖了，另外几个人（比方说whour）也指出了同样的问题。
【在 l********e 的大作中提到】
: 只有这个是正解.
: PI博后高下立判。
【在 l********e 的大作中提到】
: 只有这个是正解.
: PI博后高下立判。
x*e
20 楼
这楼说的是CRISPR出现之前用同源重组做细胞系KO啊, 看标题
【在 r******g 的大作中提到】
: 我完全混乱了
: 楼主说的这种情况，为什么需要药筛呢？
: 直接把 在 exon 或者 exon junction的 DNA double strand 用Cas9 break了，NHEJ不
: 就把target gene给敲了么
: 然后做单细胞克隆，然后再PCR筛，sequencing confirm，难道这样不是简单些么？
【在 r******g 的大作中提到】
: 我完全混乱了
: 楼主说的这种情况，为什么需要药筛呢？
: 直接把 在 exon 或者 exon junction的 DNA double strand 用Cas9 break了，NHEJ不
: 就把target gene给敲了么
: 然后做单细胞克隆，然后再PCR筛，sequencing confirm，难道这样不是简单些么？
x*e
21 楼
你肯定没读标题和主题帖。。。
【在 r******g 的大作中提到】
: 你说的是把一个药筛的cassete knock in 到target gene locus里面去么？ 还是直接
: 用homologous recombination的办法，把基因替换？
: 这个用crispr难度很大的～
: 几十个nucleotides，比如一个loxp site之类的用crispr可以knock in，东西大了弄不
: 进去的...
【在 r******g 的大作中提到】
: 你说的是把一个药筛的cassete knock in 到target gene locus里面去么？ 还是直接
: 用homologous recombination的办法，把基因替换？
: 这个用crispr难度很大的～
: 几十个nucleotides，比如一个loxp site之类的用crispr可以knock in，东西大了弄不
: 进去的...
r*g
22 楼
不好意思啊....
题目都没看清楚...
recombination rate太低了，搞不定的
【在 x********e 的大作中提到】
: 这楼说的是CRISPR出现之前用同源重组做细胞系KO啊, 看标题
题目都没看清楚...
recombination rate太低了，搞不定的
【在 x********e 的大作中提到】
: 这楼说的是CRISPR出现之前用同源重组做细胞系KO啊, 看标题
x*e
23 楼
药筛不需要考虑概率啊
【在 r******g 的大作中提到】
: 不好意思啊....
: 题目都没看清楚...
: recombination rate太低了，搞不定的
【在 r******g 的大作中提到】
: 不好意思啊....
: 题目都没看清楚...
: recombination rate太低了，搞不定的
r*g
24 楼
药筛 筛出来都是single allele
要找both alleles的recombination 就很难啊
【在 x********e 的大作中提到】
: 药筛不需要考虑概率啊
要找both alleles的recombination 就很难啊
【在 x********e 的大作中提到】
: 药筛不需要考虑概率啊
x*e
25 楼
不管single还是double都是用筛的啊
不知道可不可以提高药的dose来筛allele
【在 r******g 的大作中提到】
: 药筛 筛出来都是single allele
: 要找both alleles的recombination 就很难啊
不知道可不可以提高药的dose来筛allele
【在 r******g 的大作中提到】
: 药筛 筛出来都是single allele
: 要找both alleles的recombination 就很难啊
s*r
26 楼
传统做法的筛出来的基本都是random的integration，跟药量没关系，光用暴力筛选是
做不出来的
crispr和talen的发展对做editing的作用非常大，原来不能做的基本现在都能做了
【在 x********e 的大作中提到】
: 不管single还是double都是用筛的啊
: 不知道可不可以提高药的dose来筛allele
做不出来的
crispr和talen的发展对做editing的作用非常大，原来不能做的基本现在都能做了
【在 x********e 的大作中提到】
: 不管single还是double都是用筛的啊
: 不知道可不可以提高药的dose来筛allele
x*e
27 楼
为什么ES cell可以筛？是因为ES cell里同源重组概率大于random integration?
【在 s******r 的大作中提到】
: 传统做法的筛出来的基本都是random的integration，跟药量没关系，光用暴力筛选是
: 做不出来的
: crispr和talen的发展对做editing的作用非常大，原来不能做的基本现在都能做了
【在 s******r 的大作中提到】
: 传统做法的筛出来的基本都是random的integration，跟药量没关系，光用暴力筛选是
: 做不出来的
: crispr和talen的发展对做editing的作用非常大，原来不能做的基本现在都能做了
r*g
28 楼
ES细胞 recombination rate很高啊
做KO老鼠的时候，药筛不是同时positive selection然后negative selection么？ 这
样，理论上说random integration就被筛掉了啊
至于是不是有可能药筛不complete, KO老鼠里面会不会同时也有inregration，我觉得
是有可能的... 并且founder mice PCR一般发现不了random integration
但是这个事情无所谓啊
你就算有random integration，只要不是在target locus的同一条chromosome上面
你反复breed的过程中，random integration就被breed out了
最后还是只有KO target gene是specific
【在 x********e 的大作中提到】
: 为什么ES cell可以筛？是因为ES cell里同源重组概率大于random integration?
做KO老鼠的时候，药筛不是同时positive selection然后negative selection么？ 这
样，理论上说random integration就被筛掉了啊
至于是不是有可能药筛不complete, KO老鼠里面会不会同时也有inregration，我觉得
是有可能的... 并且founder mice PCR一般发现不了random integration
但是这个事情无所谓啊
你就算有random integration，只要不是在target locus的同一条chromosome上面
你反复breed的过程中，random integration就被breed out了
最后还是只有KO target gene是specific
【在 x********e 的大作中提到】
: 为什么ES cell可以筛？是因为ES cell里同源重组概率大于random integration?
s*r
29 楼
mES是特例，天生的整体效率比较高，其他细胞就会差非常多
做这个就是拼概率，挑出来的要么是同源的，要么是随机插入。两者之间比例能达到1
比几十几百的还能拼一下，几千几万以上的靠人力是不行的，差一两个数量级就会是能
做与不能做的区别。定点产生DNA break的新技术对同源重组效率的提升是上数量级的
，即便用了新技术随机插入还是占大部分的，但起码现在用人肉能拼一下了
【在 x********e 的大作中提到】
: 为什么ES cell可以筛？是因为ES cell里同源重组概率大于random integration?
做这个就是拼概率，挑出来的要么是同源的，要么是随机插入。两者之间比例能达到1
比几十几百的还能拼一下，几千几万以上的靠人力是不行的，差一两个数量级就会是能
做与不能做的区别。定点产生DNA break的新技术对同源重组效率的提升是上数量级的
，即便用了新技术随机插入还是占大部分的，但起码现在用人肉能拼一下了
【在 x********e 的大作中提到】
: 为什么ES cell可以筛？是因为ES cell里同源重组概率大于random integration?
x*e
30 楼
不能简便筛同源vs随机的确是目前最大的问题
1
【在 s******r 的大作中提到】
: mES是特例，天生的整体效率比较高，其他细胞就会差非常多
: 做这个就是拼概率，挑出来的要么是同源的，要么是随机插入。两者之间比例能达到1
: 比几十几百的还能拼一下，几千几万以上的靠人力是不行的，差一两个数量级就会是能
: 做与不能做的区别。定点产生DNA break的新技术对同源重组效率的提升是上数量级的
: ，即便用了新技术随机插入还是占大部分的，但起码现在用人肉能拼一下了
1
【在 s******r 的大作中提到】
: mES是特例，天生的整体效率比较高，其他细胞就会差非常多
: 做这个就是拼概率，挑出来的要么是同源的，要么是随机插入。两者之间比例能达到1
: 比几十几百的还能拼一下，几千几万以上的靠人力是不行的，差一两个数量级就会是能
: 做与不能做的区别。定点产生DNA break的新技术对同源重组效率的提升是上数量级的
: ，即便用了新技术随机插入还是占大部分的，但起码现在用人肉能拼一下了
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