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Promoter cloning 问题请教,谢谢!
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Promoter cloning 问题请教,谢谢!# Biology - 生物学
t*1
1
(中央社台北17日电)北京居,大不易。最新调查显示,北京一般家庭必须工作25年才
能够买1间住房。专家呼吁,应将这些确实是购屋自住者纳入住房保障体系。
北京晚报报导,北京工业大学和社科文献出版社今天上午联合发布「2010年北京社会建
设分析报告(蓝皮书)」,披露上述数据。
蓝皮书指出,2008年北京城镇居民人均可支配收入为2万4725元(人民币,下同),户
均可支配收入6万4285元。其中20%的高收入家庭人均可支配收入为4万7110元,户均可
支配收入为12.2万余元。20%的低收入家庭,人均可支配收入只有1万又681元,户均可
支配收入2.7万余元。
但是,2009年,北京商品房价全年涨幅高达73.5%。2008年北京房市商品住宅平均每套
面积110.7平方公尺,按照2009年11月1万7810元 /平方公尺的均价计算,购买1套90平
方公尺的普通商品住房需要160万元,相当于一般家庭25年的可支配收入。
根据2008年针对 5000户住宅的抽样调查,北京城镇居民自有住宅率是80.9%。其中居住
房改私房的占50.2%,居住商品房的仅占28.6%,居住原有私房的占 2.1%。
专家
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m*t
2
一台Seagate 1tb的移动硬盘很久没用,现在连在电脑上无法识别分区,在storage
management里可以看到这个硬盘,但是现实not initiated,选initiate却被告知
device not ready,请问各位大神这个怎么解决啊?里面还有很多重要的信息呢。
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s*a
3
之前发过相关问题帖子:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html
现在正按照大家建议扩一个3kb的promoter, 然后连接到pGL3 or 4。
我的方法:引物两端加酶切位点,外面另有三个保护碱基。
1,Q5扩片段,跑胶证明分子量对,胶回收,双酶切,连接pGL,转化,无克隆。
2,Q5扩片段,Taq加A,连接T载体,转化,无克隆。
3,Taq扩片段,连接T载体,转化,无克隆。
大家帮我分析一下,问题出在哪里。难道是一开始的引物问题么?引物会有什么问题呢?
谢谢大家!
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l*n
4
US不都是30年,还是天朝好呀
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e*i
5
一般是供电不足。
换到台式机后面的 USB 口试试。
如果能接外接电源,外接电源。

【在 m*****t 的大作中提到】
: 一台Seagate 1tb的移动硬盘很久没用,现在连在电脑上无法识别分区,在storage
: management里可以看到这个硬盘,但是现实not initiated,选initiate却被告知
: device not ready,请问各位大神这个怎么解决啊?里面还有很多重要的信息呢。

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T*e
6
看你的实验,你认为PCR没有问题,对吧。这种情况我可能会拿PCR产物测个序。确保确
实是你认为的序列。
TA cloning用的kit? PCR结束之后怎么加的overhang?放了多久?有没有跑胶?哪一
步跑的胶?转化用的什么competent cell?
我的常规做法:
Q5扩增, 跑胶确定大小,胶纯化片段,用taq加3' overhang(PCR machine上72C
10min,然后4C,或者直接拿出来放冰上),然后立即做TA cloning (invitrogen的
kit),下面就是常规转化了
根据你的描述,我不知道你TA克隆前PCR产物放了多久,有没有过胶,有没有冻。我们
实验室一哥们说这些都会让overhang掉下来,我不知道是否真的如此。不过我这一套流
程从来没有失败过(如果competent cells没有问题的话)
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D*9
7
请问天朝这房价是不是真要跌了?
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m*t
8
换了两台电脑都不行啊。没有外接的电源接口。
这个硬盘曾经插在wii上面用过,不知道会不会有影响。

【在 e*i 的大作中提到】
: 一般是供电不足。
: 换到台式机后面的 USB 口试试。
: 如果能接外接电源,外接电源。

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f*t
9
酶切之后回收一下

之前发过相关问题帖子:http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html" x-a........

【在 s**********a 的大作中提到】
: 之前发过相关问题帖子:
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html
: 现在正按照大家建议扩一个3kb的promoter, 然后连接到pGL3 or 4。
: 我的方法:引物两端加酶切位点,外面另有三个保护碱基。
: 1,Q5扩片段,跑胶证明分子量对,胶回收,双酶切,连接pGL,转化,无克隆。
: 2,Q5扩片段,Taq加A,连接T载体,转化,无克隆。
: 3,Taq扩片段,连接T载体,转化,无克隆。
: 大家帮我分析一下,问题出在哪里。难道是一开始的引物问题么?引物会有什么问题呢?
: 谢谢大家!

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y*i
10
拆出来直接连到台机主板上看看。
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b*s
11
1.酶切后需要胶纯化再做连接
2.Q5之后要用PcR产物纯化kit纯化后再用Taq加A
3. T载体是pGEMT吧,有蓝色克隆吗?没有的话就是你的载体或是感受态细胞有问题,
或是抗生素用错了。
你的PCR有你想要的条带,一般不会是引物设计的问题了。
另外建议用0.5ul T 载体,10xligase buffer,加ligase,然后加的PcR胶纯化产物至
最终体积,4度过夜
祝好运!
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m*t
12
实在不行就只能破坏外壳了。只是想看看到底有没有可能的办法

【在 y****i 的大作中提到】
: 拆出来直接连到台机主板上看看。
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s*a
13
谢谢楼上各位热心大牛朋友。我还得再试试。
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t*d
14
再插回wii看看,在wii上能不能用。
找个可以接供电的usb hub上看看。

【在 m*****t 的大作中提到】
: 换了两台电脑都不行啊。没有外接的电源接口。
: 这个硬盘曾经插在wii上面用过,不知道会不会有影响。

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s*r
15
Use DNA concentration kit to purify your PCR product, elute in 45ul of H2O,
check concentration. Then cut PCR product for 3 hours, gel purify, ligate
and transform.
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t*u
16
wii的硬盘格式是专用的

【在 m*****t 的大作中提到】
: 换了两台电脑都不行啊。没有外接的电源接口。
: 这个硬盘曾经插在wii上面用过,不知道会不会有影响。

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x*e
17
PCR之后TA ligation
如果这都不成功就要考虑片段是否有毒性了

呢?

【在 s**********a 的大作中提到】
: 之前发过相关问题帖子:
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html
: 现在正按照大家建议扩一个3kb的promoter, 然后连接到pGL3 or 4。
: 我的方法:引物两端加酶切位点,外面另有三个保护碱基。
: 1,Q5扩片段,跑胶证明分子量对,胶回收,双酶切,连接pGL,转化,无克隆。
: 2,Q5扩片段,Taq加A,连接T载体,转化,无克隆。
: 3,Taq扩片段,连接T载体,转化,无克隆。
: 大家帮我分析一下,问题出在哪里。难道是一开始的引物问题么?引物会有什么问题呢?
: 谢谢大家!

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l*c
18
This makes sense.
If you plug a MacOS HD or Linux HD on windows machine, windows cannot read
it.
Different file systems.

【在 t*********u 的大作中提到】
: wii的硬盘格式是专用的
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n*d
19
参照in-fusion克隆的原理设计引物,不用买in-fusion试剂盒。
将vector和insert pcr出来,混合,用dpnI消化一下去掉原载体,接着无需其他操作。
然后trans dh5a转化,
接着祈祷大肠杆菌神能顺利将这两个片段重组!
然后,colony pcr,菌神将保佑你得到正确的阳性克隆。
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m*t
20
WBFS是PC用的软件,只有PC能认到分区才能格式化成WBFS格式,格式化之后还可以认到
分区只是认不到里面的任何内容。

【在 t*********u 的大作中提到】
: wii的硬盘格式是专用的
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n*d
21
如果载体pcr时,模板加太多,造成dpnI消化不掉原载体的话,你将无法得到菌神的庇
佑!

:参照in-fusion克隆的原理设计引物,不用买in-fusion试剂盒。
:将vector和insert pcr出来,混合,用dpnI消化一下去掉原载体,接着无需其他操作
。然后trans dh5a转化,
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T*e
22
模板确实是个关键因素。Q5不喜欢太多的模板,而Taq忍耐性更强一点。不过楼主PCR似
乎没有问题。
我喜欢你这句"你将无法得到菌神的庇佑!" 看来你很enjoy实验
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n*d
23
我九楼的内容指的是我在八楼提到的克隆方法的应该注意的点。
此法仅靠菌神做重组就可以,不需要额外加重组酶,不需要酶切连接步骤!
我个人本是非常enjoy实验的,只可惜目前跟ap老板观点总相左,正被老板疏远中!

:模板确实是个关键因素。Q5不喜欢太多的模板,而Taq忍耐性更强一点。不过楼主PCR
似乎没有问题。
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x*e
24
什么叫重组?NHEJ?这种插入方法两端不会有很多突变吗

PCR

【在 n*******d 的大作中提到】
: 我九楼的内容指的是我在八楼提到的克隆方法的应该注意的点。
: 此法仅靠菌神做重组就可以,不需要额外加重组酶,不需要酶切连接步骤!
: 我个人本是非常enjoy实验的,只可惜目前跟ap老板观点总相左,正被老板疏远中!
:
: :模板确实是个关键因素。Q5不喜欢太多的模板,而Taq忍耐性更强一点。不过楼主PCR
: 似乎没有问题。
: :

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n*d
25
同源重组,反正目前没看到突变,所以应该不是NHEJ
菌神觉得NHEJ对他不重要

:什么叫重组?NHEJ?这种插入方法两端不会有很多突变吗
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H*i
26
Linear DNA 转化? 那必须是电转吧?
而且我记得大多数cloning strain都是recombinase不活跃的菌株啊

【在 n*******d 的大作中提到】
: 同源重组,反正目前没看到突变,所以应该不是NHEJ
: 菌神觉得NHEJ对他不重要
:
: :什么叫重组?NHEJ?这种插入方法两端不会有很多突变吗
: :

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n*d
27
不是电转,用的trans5a,确实不是每个公司的dh5a都能出
欢迎尝试大肠菌神教克隆大法,
克隆大法好!

:Linear DNA 转化? 那必须是电转吧?
:而且我记得大多数cloning strain都是recombinase不活跃的菌株啊
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x*e
28
有片段大小的限制吗?如果这么容易克隆我干嘛做recobineering啊

【在 n*******d 的大作中提到】
: 不是电转,用的trans5a,确实不是每个公司的dh5a都能出
: 欢迎尝试大肠菌神教克隆大法,
: 克隆大法好!
:
: :Linear DNA 转化? 那必须是电转吧?
: :而且我记得大多数cloning strain都是recombinase不活跃的菌株啊

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n*d
29
我们实验室最大的做过七八k的
克隆大法好,欢迎皈依我教

:有片段大小的限制吗?如果这么容易克隆我干嘛做recobineering啊
avatar
x*e
30
质粒有要求吗? 我试试,如果有幸得大神庇佑,我就无脑入教了

【在 n*******d 的大作中提到】
: 我们实验室最大的做过七八k的
: 克隆大法好,欢迎皈依我教
:
: :有片段大小的限制吗?如果这么容易克隆我干嘛做recobineering啊
: :

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n*d
31
基本上唯二的要求就是
1,p亮点,越亮越容易出。2,p载体的时候模板加少点,少于100pg,不然dpni切不干
净,假阳性多。
有paper报道过这个方法,只是目前我找不到了。
欢迎无脑入教,将本教克隆大法发扬光大。哈哈哈哈!

:质粒有要求吗? 我试试,如果有幸得大神庇佑,我就无脑入教了
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C*4
32
你PGL3酶切以后有小片段出来和跑胶纯化没有?PCR引物在5端有没有留足够的碱基?有
些要3个才能有效切开。
Q5扩增很猛,可能你3K的片段在和Vector混合的比例不对。
T4LIGASE或者它的BUFFER 里的ATP没了都有可能造成转化不出克隆。
酶切点是甲基化不敏感类型吗?
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